Повышение ценности красных морских водорослей Gracilaria gracilis с помощью биоперерабатывающего подхода
Summary
Здесь мы опишем несколько протоколов, направленных на комплексную оценку Gracilaria gracilis: сбор дикорастущих видов, выращивание в домашних условиях и экстракция биологически активных ингредиентов. Оценивается антиоксидантное, антимикробное и цитотоксическое действие экстрактов, а также оценка питательности и стабильности пищи, обогащенной биомассой и пигментами цельных морских водорослей.
Abstract
Интерес к морским водорослям как к обильному исходному материалу для получения ценных и многоцелевых биологически активных ингредиентов постоянно растет. В этой работе мы исследуем потенциал Gracilaria gracilis, съедобных красных водорослей, культивируемых во всем мире из-за их коммерческого интереса в качестве источника агара и других ингредиентов для косметических, фармакологических, пищевых и кормовых применений.
Условия роста G. gracilis были оптимизированы за счет вегетативного размножения и спороношения при одновременном манипулировании физико-химическими условиями для достижения большого запаса биомассы. Методы «зеленой» экстракции с использованием этанола и воды были выполнены над биомассой морских водорослей. Биоактивный потенциал экстрактов оценивали с помощью комплекса анализов in vitro на предмет их цитотоксичности, антиоксидантных и антимикробных свойств. Кроме того, высушенная биомасса морских водорослей была включена в рецептуры макаронных изделий для повышения питательной ценности пищи. Пигменты, извлеченные из G. gracilis , также были включены в йогурт в качестве натурального красителя, и была оценена их стабильность. Оба продукта были представлены на суд полуобученной сенсорной комиссии, целью которой было достижение наилучшей конечной формулы до выхода на рынок.
Результаты подтверждают универсальность G. gracilis независимо от того, применяется ли он в виде целой биомассы, экстрактов и/или пигментов. Благодаря внедрению нескольких оптимизированных протоколов эта работа позволяет разрабатывать продукты, которые могут принести прибыль рынкам продуктов питания, косметики и аквакультуры, способствуя экологической устойчивости и «голубой» экономике замкнутого цикла.
Кроме того, в соответствии с подходом к биопереработке, остаточная биомасса морских водорослей будет использоваться в качестве биостимулятора для роста растений или преобразована в углеродные материалы, которые будут использоваться для очистки воды в собственных системах аквакультуры MARE-Polytechnic в Лейрии, Португалия.
Introduction
Морские водоросли можно рассматривать как интересное природное сырье для фармацевтической, пищевой, кормовой и экологической отраслей. Они биосинтезируют множество молекул, многие из которых не встречаются в наземных организмах, обладающих соответствующими биологическими свойствами 1,2. Тем не менее, для обеспечения большого запаса биомассы необходимо внедрить оптимизированные для морских водорослей протоколы выращивания.
Методы выращивания всегда должны учитывать природу слоевищ водорослей и общую морфологию. Gracilaria gracilis является клональным таксоном, что означает, что орган прикрепления производит несколько вегетативных осей. Таким образом, достигается размножение путем фрагментации (вегетативное размножение), так как каждая из этих осей полностью способна к самостоятельной жизни от основного слоевища3. Клональные таксоны могут быть успешно интегрированы с помощью простых и быстрых одноэтапных методологий культивирования, так как большое количество биомассы получается путем расщепления слоевища на мелкие фрагменты, которые быстро регенерируют и вырастают в новых, генетически идентичных особей. В этом процессе могут использоваться как гаплонтические, так и диплонтические слоевища. Несмотря на то, что род демонстрирует сложный гапло-диплонтический изоморфный трехфазный жизненный цикл, спороношение редко требуется, за исключением тех случаев, когда требуется генетическое обновление запасов для получения улучшенных урожаев. В этом случае как тетраспоры (гаплонтические споры, образующиеся мейозом), так и карпоспоры (диплонтические споры, образующиеся в результате митоза) дают начало макроскопическим слоевищам, которые затем могут быть выращены и размножаться путем вегетативного размножения4. Циклы роста диктуются условиями окружающей среды и физиологическим состоянием особей, а также другими биологическими факторами, такими как появление эпифитов и сцепление других организмов. Таким образом, оптимизация условий выращивания имеет решающее значение для обеспечения высокой продуктивности и производства высококачественной биомассы5.
Извлечение биологически активных соединений из морских водорослей, включая G. gracilis, может быть достигнуто различными методами 6,7. Выбор метода экстракции зависит от конкретных интересующих соединений, целевого применения и характеристик морских водорослей. В этом исследовании мы сосредоточились на жидкостной экстракции, которая включает в себя использование зеленых растворителей, таких как вода или этанол, для растворения и извлечения биологически активных соединений из биомассы морских водорослей. Экстракция может осуществляться с помощью мацерации универсальным и эффективным способом и может использоваться для широкого спектра соединений. Это простой и широко используемый метод, включающий замачивание биомассы в растворителе в течение длительного периода времени, как правило, при комнатной или слегка повышенной температуре. Растворитель перемешивают для усиления процесса экстракции. По истечении требуемого времени экстракции растворитель отделяется от твердого материала путем фильтрации или центрифугирования.
Вода является широко используемым растворителем в пищевой промышленности из-за ее безопасности, доступности и совместимости с широким спектром пищевых продуктов. Водная экстракция подходит для полярных соединений, таких как полисахариды, пептиды и некоторые фенольные соединения. Однако он не может эффективно извлекать неполярные соединения. Этанол также широко используется в качестве растворителя в пищевых продуктах и может быть эффективным для извлечения различных биологически активных молекул, включая фенольные соединения, флавоноиды и некоторые пигменты. Этанол в целом признан безопасным для использования в пищевых продуктах и может легко испаряться, оставляя после себя извлеченные соединения. Стоит отметить, что при выборе метода экстракции следует учитывать такие факторы, как эффективность, селективность, экономичность и воздействие на окружающую среду. Оптимизация параметров экстракции, таких как концентрация растворителя, время экстракции, температура и давление, имеет решающее значение для достижения оптимального выхода биологически активных соединений из G. gracilis или других морских водорослей.
Было обнаружено, что морские водоросли проявляют антимикробную активность в отношении широкого спектра микроорганизмов, включая бактерии, грибки и вирусы8. Эта активность объясняется биологически активными компонентами, включая фенольные соединения, полисахариды, пептиды и жирные кислоты. Несколько исследований продемонстрировали их эффективность против таких патогенов, как Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. и Pseudomonas aeruginosa, среди прочих9. Антимикробная активность морских водорослей объясняется присутствием биологически активных соединений, которые могут вмешиваться в микробные клеточные стенки, мембраны, ферменты и сигнальные пути10. Эти соединения могут нарушать рост микробов, ингибировать образование биопленки и модулировать иммунные реакции.
Красные водоросли, также известные как родофиты, представляют собой группу водорослей, которые могут проявлять антимикробную активность против различных микроорганизмов. В этой группе G. gracilis содержит различные биологически активные соединения, которые могут способствовать его антимикробной активности. В то время как конкретные молекулы могут варьироваться, общими классами, которые были зарегистрированы у G. gracilis и могут обладать антимикробными свойствами, являются полисахариды, фенолы, терпеноиды и пигменты11. Однако важно отметить, что наличие и количество этих компонентов может варьироваться в зависимости от таких факторов, как место сбора водорослей, сезонность, физиологическое состояние слоевища и условия окружающей среды. Таким образом, конкретный класс и концентрация антимикробных соединений в G. gracilis могут варьироваться соответствующим образом.
Также было обнаружено, что G. gracilis обладает антиоксидантными свойствами, содержа различные фенольные соединения, которые, как было показано, поглощают свободные радикалы и снижают окислительныйстресс.Антиоксиданты помогают защитить клетки от повреждений, вызванных активными формами кислорода, и имеют потенциальную пользу для здоровья. Антиоксидантная способность может быть оценена непосредственно с помощью различных методов, включая активность 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) по удалению свободных радикалов и, косвенно, через количественное определение общего содержания полифенольных соединений (TPC)13.
Несмотря на то, что ингредиент, как сообщается, обладает выраженной биологической активностью, оценка его цитотоксичности необходима при оценке натуральных и синтетических веществ, используемых в контакте с живыми клетками или тканями. Существует несколько методов измерения цитотоксичности, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения. В целом, они предлагают ряд возможностей для оценки вредного воздействия многих веществ на клетки и, в то же время, для исследования механизмов поврежденияи гибели клеток.
В этой работе мы используем 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), колориметрический метод, введенный Мосманном (1983)15. Этот метод измеряет восстановление солей тетразолия до пурпурного формазана метаболически активными клетками. Чем выше количество кристаллов формазана, тем выше число жизнеспособных клеток, что обеспечивает косвенную меру цитотоксичности14. Поскольку в данной работе водные и этаноловые экстракты G. gracilis предназначены для включения в дермокосметические составы, оценка цитотоксичности in vitro проводится в клеточной линии кератиноцитов (HaCaT).
Что касается применения в пищу, морские водоросли, как правило, низкокалорийны и богаты питательными веществами пищевыми волокнами, незаменимыми элементами и аминокислотами, полисахаридами, полиненасыщенными жирными кислотами, полифенолами и витаминами 2,16. G. gracilis не является исключением, обладая интересной пищевой ценностью. Freitas et al. (2021)4 обнаружили, что культивируемый G. gracilis имеет более высокий уровень белка и витамина С и поддерживает уровень общих липидов по сравнению с дикими морскими водорослями. Это может представлять собой экономическое и экологическое преимущество, поскольку с точки зрения питания производство предпочтительнее, чем эксплуатация диких ресурсов. Кроме того, потребители все больше обеспокоены типом пищи, которую они едят, поэтому важно вводить новые ингредиенты для обогащения пищевых продуктов и использовать новые ресурсы для получения экстрактов, которые могут повысить ценность продукта и претендовать на «чистую этикетку». Кроме того, современный рынок характеризуется высокой конкуренцией, требующей разработки новых продуктов и инновационных стратегий, позволяющих дифференцировать производителей от их конкурентов17.
Обогащение продуктов с низкой питательной ценностью, таких как макаронные изделия, морскими ресурсами, в том числе морскими водорослями, является стратегией внедрения этого ресурса в качестве нового продукта питания и стратегии дифференциации рынка за счет продукта с определенной питательной ценностью. С другой стороны, G. gracilis является источником природных красных пигментов, таких как фикобилипротеины18, обладающие высоким потенциалом для применения в пищевой промышленности. Эта водоросль проявила большой интерес в нескольких областях, и ее применение может быть произведено с использованием целых водорослей, экстрактов и/или оставшейся биомассы. В данной работе мы демонстрируем некоторые примеры таких приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Испытания на антимикробную активность в жидкой среде используются для оценки эффективности антимикробных веществ против микроорганизмов, взвешенных в жидкой среде, и обычно проводятся для определения способности вещества подавлять рост или убивать микроорганизмы35,36,37,38</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Португальским фондом науки и технологий (FCT) в рамках стратегических проектов, предоставленных Центру морских и экологических наук MARE-(UIDP/04292/2020 и UIDB/04292/2020) и ассоциированной лаборатории ARNET (LA/P/0069/2020). FCT также профинансировал индивидуальные докторские гранты, присужденные Марте В. Фрейтас (UI/BD/150957/2021) и Татьяне Перейре (2021. 07791. БД). Эта работа также была финансово поддержана проектом HP4A – ЗДОРОВЫЕ МАКАРОНЫ ДЛЯ ВСЕХ (совместная реклама No 039952), софинансируемым ЕФРР – Европейским фондом регионального развития в рамках Программы Португалия 2020 в рамках Оперативной программы конкурентоспособности и интернационализации COMPETE 2020.
Materials
| Absolute Ethanol | Aga, Portugal | 64-17-5 | |
| Ammonium Chloride | PanReac | 12125-02-9 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| Analytical scale balance | Sartorius, TE124S | 22105307 | |
| Bacillus subtilis subsp. spizizenii | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 347 | |
| Biotin | Panreac AppliChem | 58-85-5 | |
| Centrifuge | Eppendorf, 5810R | 5811JH490481 | |
| Chloramphenicol | PanReac | 56-75-7 | |
| CO2 Chamber | Memmert | N/A | |
| Cool White Fluorescent Lamps | OSRAM Lumilux Skywhite | N/A | |
| Densitometer McFarland | Grant Instruments | N/A | |
| DMEM medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | |
| DPPH | Sigma, Steinheim, Germany | 1898-66-4 | |
| Escherichia coli (DSM 5922) | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM5922 | |
| Ethanol 96% | AGA-Portugal | 64-17-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (Na2EDTA) | J.T.Baker | 6381-92-6 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Filter Paper (Whatman No.1) | Whatman | WHA1001320 | |
| Flasks | VWR International, Alcabideche, Portugal | N/A | |
| Folin-Ciocalteu | VWR Chemicals | 31360.264 | |
| Gallic Acid | Merck | 149-91-7 | |
| Germanium (IV) Oxide, 99.999% | AlfaAesar | 1310-53-8 | |
| HaCaT cells – 300493 | CLS-Cell Lines Services, Germany | 300493 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | IKA, C-MAG HS7 | 06.090564 | |
| Iron Sulfate | VWR Chemicals | 10124-49-9 | |
| Laminar flow hood | TelStar, Portugal | 526013 | |
| LB Medium | VWR Chemicals | J106 | |
| Listonella anguillarum | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) | DSM 21597 | |
| Manganese Chloride | VWR Chemicals | 7773.01.5 | |
| Micropipettes | Eppendorf, Portugal | N/A | |
| Microplates | VWR International, Alcabideche, Portugal | 10861-666 | |
| Microplates | Greiner | 738-0168 | |
| Microplates (sterile) | Fisher Scientific | 10022403 | |
| Microplate reader | Epoch Microplate Spectrophotometer, BioTek, Vermont, USA | 1611151E | |
| MTT | Sigma-Aldrich | 289-93-1 | |
| Muller-Hinton Broth (MHB) | VWR Chemicals | 90004-658 | |
| Oven | Binder, FD115 | 12-04490 | |
| Oven | Binder, BD115 | 04-62615 | |
| Penicillin | Sigma-Aldrich | 1406-05-9 | |
| pH meter Inolab | VWR International, Alcabideche, Portugal | 15212099 | |
| Pippete tips | Eppendorf, Portugal | 5412307 | |
| Pyrex Bottles Media Storage | VWR International, Alcabideche, Portugal | 16157-169 | |
| Rotary Evaporator | Heidolph, Laborota 4000 | 80409287 | |
| Rotavapor | IKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal | 07.524254 | |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Chem-Lab | 497-19-8 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Normax Chem | 7647-14-5 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Riedel-de Haën | 7558-79-4 | |
| SpectraMagic NX | Konica Minolta, Japan | color data analysis software | |
| Spectrophotometer | Evolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, USA | 5A4T092004 | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | 57-92-1 | |
| Thiamine | Panreac AppliChem | 59-43-8 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tryptic Soy Agar (TSA) | VWR Chemicals | ICNA091010617 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | VWR Chemicals | 22091 | |
| Ultrapure water | Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, Germany | F5HA17360B | |
| Vacuum pump | Buchi, Switzerland | FIS05-402-103 | |
| Vitamin B12 | Merck | 68-19-9 |
References
- Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
- Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
- Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. . Seaweed Ecology and Physiology. (second). , (2014).
- Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562 (2021).
- Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
- Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516 (2021).
- Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O’Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
- Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H., Ravishankar, G., Ambati, R. R. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. , (2019).
- Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
- Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81 (2016).
- Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492 (2018).
- Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
- Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J., Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. , 299-341 (2023).
- Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. . Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , 111822 (2023).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
- Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769 (2023).
- Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688 (2020).
- Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C., Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. . New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. , (2014).
- Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
- Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
- NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, M02-M11 (2012).
- Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
- Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
- Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611 (2020).
- Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- ISO 6865. Animal feeding stuffs – Determination of crude fibre content – Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
- Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
- Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482 (2022).
- Food energy – methods of analysis and conversion factors. Available from: https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003)
- . 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011 Available from: https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011)
- Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
- ISO 4120. Sensory analysis – Methodology – Triangle test. International Standard. , (2004).
- Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427 (2022).
- Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068 (2023).
- Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364 (2017).
- Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642 (2020).
- Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380 (2021).
- Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
- Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431 (2021).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).
