Dit protocol beschrijft een workflow van ex vivo of in vitro celculturen tot transcriptomische gegevensvoorverwerking voor kosteneffectieve transcriptoomgebaseerde geneesmiddelenscreening.
Transcriptomics maakt het mogelijk om uitgebreide inzichten te verkrijgen in cellulaire programma’s en hun reacties op verstoringen. Ondanks een aanzienlijke daling van de kosten van bibliotheekproductie en -sequencing in het afgelopen decennium, blijft het toepassen van deze technologieën op de schaal die nodig is voor het screenen van geneesmiddelen onbetaalbaar, waardoor het enorme potentieel van deze methoden wordt belemmerd. Onze studie presenteert een kosteneffectief systeem voor transcriptoomgebaseerde screening van geneesmiddelen, waarbij geminiaturiseerde verstoringsculturen worden gecombineerd met mini-bulk transcriptomics. Het geoptimaliseerde mini-bulkprotocol biedt informatieve biologische signalen op kosteneffectieve sequencingdiepte, waardoor uitgebreide screening van bekende geneesmiddelen en nieuwe moleculen mogelijk is. Afhankelijk van de gekozen behandeling en incubatietijd zal dit protocol binnen ongeveer 2 dagen resulteren in sequencing libraries. Door verschillende stoppunten binnen dit protocol kan de bibliotheekvoorbereiding, evenals de sequencing, tijdonafhankelijk worden uitgevoerd. Het gelijktijdig verwerken van een groot aantal monsters is mogelijk; De meting van maximaal 384 monsters werd getest zonder verlies van gegevenskwaliteit. Er zijn ook geen bekende beperkingen aan het aantal aandoeningen en/of geneesmiddelen, ondanks het feit dat rekening wordt gehouden met de variabiliteit in optimale incubatietijden van geneesmiddelen.
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is een complex en tijdrovend proces waarbij potentiële geneesmiddelen en hun doelwitten worden geïdentificeerd, kandidaat-geneesmiddelen worden geoptimaliseerd en gesynthetiseerd, en hun werkzaamheid en veiligheid worden getest in preklinische en klinische onderzoeken. Traditionele methoden voor het screenen van geneesmiddelen, d.w.z. de systematische beoordeling van bibliotheken van kandidaat-verbindingen voor therapeutische doeleinden, omvatten het gebruik van diermodellen of celgebaseerde assays om de effecten op specifieke doelen of routes te testen. Hoewel deze methoden succesvol zijn geweest in het identificeren van kandidaat-geneesmiddelen, gaven ze vaak onvoldoende inzicht in de complexe moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de werkzaamheid van geneesmiddelen en ook in de toxiciteit en mechanismen van mogelijke bijwerkingen.
Het beoordelen van genoombrede transcriptietoestanden biedt een krachtige benadering om de huidige beperkingen bij het screenen van geneesmiddelen te overwinnen, omdat het uitgebreide beoordelingen van genexpressie mogelijk maakt als reactie op medicamenteuze behandelingen. Door RNA-transcripten op een genoombrede manier te meten die op een bepaald moment tot expressie worden gebracht, wil transcriptomics een holistisch beeld geven van de transcriptionele veranderingen die optreden als reactie op geneesmiddelen, waaronder veranderingen in genexpressiepatronen, alternatieve splicing en niet-coderende RNA-expressie3. Deze informatie kan worden gebruikt om medicijndoelen te bepalen, de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te voorspellen en de dosering en behandelingsregimes van geneesmiddelen te optimaliseren.
Een van de belangrijkste voordelen van het combineren van transcriptomics met onbevooroordeelde screening van geneesmiddelen is het potentieel om nieuwe medicijndoelen te identificeren die nog niet eerder zijn overwogen. Conventionele benaderingen voor het screenen van geneesmiddelen zijn vaak gericht op gevestigde doelmoleculen of -routes, waardoor de identificatie van nieuwe doelwitten wordt belemmerd en mogelijk wordt geleid tot geneesmiddelen met onvoorziene bijwerkingen en beperkte effectiviteit. Transcriptomics kan deze beperkingen overwinnen door inzicht te geven in de moleculaire veranderingen die optreden als reactie op medicamenteuze behandeling, waardoor potentiële doelen of routes aan het licht komen die mogelijk niet eerder zijn overwogen2.
Naast de identificatie van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen, kan transcriptomics ook worden gebruikt om de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te voorspellen. Door de genexpressiepatronen te analyseren die verband houden met geneesmiddelresponsen, kunnen biomarkers worden ontwikkeld die kunnen worden gebruikt om de reactie van een patiënt op een bepaald medicijn of behandelingsregime te voorspellen. Dit kan ook helpen om de dosering van geneesmiddelen te optimaliseren en het risico op nadelige bijwerkingen te verminderen4.
Ondanks de potentiële voordelen blijven de kosten van transcriptomics een belangrijke belemmering voor de wijdverbreide toepassing ervan bij het screenen van geneesmiddelen. Transcriptomische analyse vereist gespecialiseerde apparatuur, technische expertise en data-analyse, wat het voor kleinere onderzoeksteams of organisaties met beperkte financiering een uitdaging kan maken om transcriptomics te gebruiken bij het screenen van geneesmiddelen. De kosten van transcriptomics zijn echter gestaag gedaald, waardoor het toegankelijker is geworden voor de onderzoeksgemeenschappen. Bovendien hebben technologische vooruitgang en methoden voor gegevensanalyse transcriptomics efficiënter en kosteneffectiever gemaakt, waardoor de toegankelijkheid verder is toegenomen2.
In dit protocol beschrijven we een hoogdimensionaal en exploratief systeem voor transcriptoom-gebaseerde drug screening, waarbij geminiaturiseerde perturbatieculturen worden gecombineerd met mini-bulk transcriptomics analyse 5,6. Met dit protocol is het mogelijk om de kosten per monster te verlagen tot 1/6evan de huidige kosten van commerciële oplossingen voor mRNA-sequencing van volledige lengte. Het protocol vereist alleen standaard laboratoriumapparatuur, met als enige uitzondering het gebruik van short-read sequencing-technologieën, die kunnen worden uitbesteed als sequencing-instrumenten niet in huis beschikbaar zijn. Het geoptimaliseerde mini-bulkprotocol levert informatierijke biologische signalen op kosteneffectieve sequencingdiepte, waardoor een uitgebreide screening van bekende geneesmiddelen en nieuwe moleculen mogelijk is.
Het doel van het experiment is om te screenen op geneesmiddelactiviteit op PBMC’s in verschillende biologische contexten. Dit protocol kan worden toegepast op elke biologische vraag waarbij verschillende geneesmiddelen moeten worden getest met een transcriptomische uitlezing, waardoor een transcriptoombreed beeld wordt gegeven van het cellulaire effect van de behandeling.
Het ontdekken en ontwikkelen van geneesmiddelen kan veel baat hebben bij de holistische kijk op cellulaire processen die bulktranscriptomics kan bieden. Desalniettemin wordt deze aanpak vaak beperkt door de hoge kosten van het experiment met het standaard bulk RNA-seq-protocol, waardoor de toepassing ervan in academische omgevingen en het potentieel voor industriële schaalbaarheid worden verhinderd.
De meest kritische stappen van het protocol zijn het ontdooien van de cellen en de eerste stap…
The authors have nothing to disclose.
J.L.S. wordt ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) in het kader van de Duitse excellentiestrategie (EXC2151-390873048) en in het kader van SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammatie, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, het door BMBF gefinancierde excellentieproject Diet-Body-Brain (DietBB); en het EU-project SYSCID onder subsidienummer 733100. M.B. wordt ondersteund door DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. wordt ondersteund door DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – Projectnummer 513977171) en de Duitse Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Afbeeldingen gemaakt met BioRender.com.
50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |