비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝
Summary
이 프로토콜은 비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝을 위해 체외 또는 체외 세포 배양에서 전사체 데이터 전처리까지의 워크플로우를 설명합니다.
Abstract
전사체학을 통해 세포 프로그램과 섭동에 대한 반응에 대한 포괄적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 지난 10년 동안 라이브러리 생산 및 염기서열 분석 비용이 크게 감소했음에도 불구하고 약물 스크리닝에 필요한 규모로 이러한 기술을 적용하는 것은 여전히 엄청난 비용이 들기 때문에 이러한 방법의 엄청난 잠재력을 가로막고 있습니다. 우리의 연구는 소형화된 섭동 배양과 미니 벌크 전사체학을 결합한 전사체 기반 약물 스크리닝을 위한 비용 효율적인 시스템을 제시합니다. 최적화된 mini-bulk 프로토콜은 비용 효율적인 염기서열분석 깊이에서 유익한 생물학적 신호를 제공하여 알려진 약물 및 새로운 분자에 대한 광범위한 스크리닝을 가능하게 합니다. 선택한 처리 및 배양 시간에 따라 이 프로토콜은 약 2일 이내에 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다. 이 프로토콜 내의 여러 중지 지점으로 인해 라이브러리 준비와 염기서열분석은 시간에 관계없이 수행할 수 있습니다. 많은 수의 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 최대 384개의 샘플 측정이 데이터 품질 손실 없이 테스트되었습니다. 또한 최적의 약물 배양 시간의 변동성을 고려했음에도 불구하고 조건 및/또는 약물의 수에 대한 알려진 제한은 없습니다.
Introduction
신약 개발은 잠재적 약물과 표적을 식별하고, 약물 후보를 최적화 및 합성하고, 전임상 및 임상 시험에서 효능과 안전성을 테스트하는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다1. 약물 스크리닝을 위한 전통적인 방법, 즉 치료 목적을 위한 후보 화합물 라이브러리의 체계적인 평가에는 특정 표적 또는 경로에 대한 효과를 테스트하기 위해 동물 모델 또는 세포 기반 분석을 사용하는 것이 포함됩니다. 이러한 방법은 약물 후보를 식별하는 데 성공적이었지만 약물 효능의 기초가 되는 복잡한 분자 메커니즘과 잠재적 부작용의 독성 및 메커니즘에 대한 충분한 통찰력을 제공하지 못하는 경우가 많았습니다.
게놈 전반의 전사 상태를 평가하는 것은 약물 치료에 대한 반응으로 유전자 발현을 포괄적으로 평가할 수 있기 때문에 현재 약물 스크리닝의 한계를 극복할 수 있는 강력한 접근 방식을 제시합니다2. 주어진 시간에 발현되는 게놈 전체 방식으로 RNA 전사체를 측정함으로써 전사체학은 유전자 발현 패턴의 변화, 선택적 스플라이싱 및 비코딩 RNA 발현 3을 포함하여 약물에 대한 반응에서 발생하는 전사 변화에 대한 전체적인 관점을 제공하는 것을 목표로 합니다3. 이 정보는 약물 표적을 결정하고, 약물 효능 및 독성을 예측하고, 약물 투여 및 치료 요법을 최적화하는 데 사용할 수 있습니다.
트랜스크립토믹스와 편견 없는 약물 스크리닝을 결합하는 주요 이점 중 하나는 이전에 고려되지 않았던 새로운 약물 표적을 식별할 수 있다는 것입니다. 기존의 약물 스크리닝 접근법은 확립된 표적 분자 또는 경로에 초점을 맞추는 경우가 많아 새로운 표적의 식별을 방해하고 잠재적으로 예상치 못한 부작용과 제한된 효과를 가진 약물을 초래할 수 있습니다. 전사체학은 약물 치료에 반응하여 발생하는 분자 변화에 대한 통찰력을 제공하고 이전에는 고려되지 않았을 수 있는 잠재적인 표적 또는 경로를 밝혀냄으로써 이러한 한계를 극복할 수 있습니다2.
새로운 약물 표적을 식별하는 것 외에도 전사체학은 약물 효능 및 독성을 예측하는 데에도 사용할 수 있습니다. 약물 반응과 관련된 유전자 발현 패턴을 분석함으로써 특정 약물 또는 치료 요법에 대한 환자의 반응을 예측하는 데 사용할 수 있는 바이오마커를 개발할 수 있습니다. 이는 또한 약물 투여를 최적화하고 부작용의 위험을 줄이는 데 도움이 될 수 있다4.
잠재적인 이점에도 불구하고 전사체학의 비용은 약물 스크리닝에 널리 적용되는 데 중요한 장벽으로 남아 있습니다. 전사체 분석에는 전문 장비, 기술 전문 지식 및 데이터 분석이 필요하므로 소규모 연구팀이나 자금이 제한된 조직에서는 약물 스크리닝에 전사체학을 활용하기가 어려울 수 있습니다. 그러나 전사체학의 비용은 꾸준히 감소하여 연구 커뮤니티에서 더 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 또한 기술 및 데이터 분석 방법의 발전으로 전사체학이 보다 효율적이고 비용 효율적이며 접근성이 더욱 높아졌습니다2.
이 프로토콜에서는 소형 섭동 배양과 미니 벌크 전사체학 분석을 결합한 전사체 기반 약물 스크리닝을 위한 고차원 탐색 시스템을 설명합니다 5,6. 이 프로토콜을 사용하면 샘플당 비용을 전체 길이 mRNA 염기서열분석을 위한 현재 상용 솔루션비용의 1/6로 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비만 필요하며, 유일한 예외는 짧은 판독 염기서열분석 기술을 사용하는 것이며, 염기서열분석 장비를 사내에서 사용할 수 없는 경우 아웃소싱할 수 있습니다. 최적화된 미니 벌크 프로토콜은 비용 효율적인 염기서열분석 깊이에서 정보가 풍부한 생물학적 신호를 제공하여 알려진 약물 및 새로운 분자에 대한 광범위한 스크리닝을 가능하게 합니다.
이 실험의 목적은 다양한 생물학적 맥락에서 PBMC의 약물 활성을 스크리닝하는 것입니다. 이 프로토콜은 전사체 판독으로 여러 약물을 테스트해야 하는 모든 생물학적 질문에 적용할 수 있으며, 치료의 세포 효과에 대한 전사체 전체 보기를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
약물 발견 및 약물 개발은 벌크 전사체학이 제공할 수 있는 세포 과정에 대한 전체론적 관점으로부터 큰 이점을 얻을 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 접근법은 표준 벌크 RNA-seq 프로토콜을 사용한 실험의 높은 비용으로 인해 제한되는 경우가 많으며, 이는 학술 환경에서의 적용과 산업 확장성 가능성을 금지합니다.
프로토콜의 가장 중요한 단계는 세포 해동과 라이브러리…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JLS는 독일의 우수성 전략(EXC2151-390873048)과 SCHU 950/8-1에 따라 독일 연구 재단(DFG)의 지원을 받습니다. GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF 자금 지원 우수 프로젝트 Diet-Body-Brain (DietBB); 및 보조금 번호 733100에 따른 EU 프로젝트 SYSCID. M.B.는 DFG에서 지원됩니다(IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B.는 DFG(ImmuDiet BO 6228/2-1 – 프로젝트 번호 513977171) 및 Germany’s Excellence Strategy(EXC2151-390873048)의 지원을 받습니다. BioRender.com 로 만든 이미지.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
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