Hybridation Réaction en chaîne ARN Fluorescence intégrale Hybridation in situ de gènes chimiosensoriels dans les appendices olfactifs des moustiques
Summary
L’article décrit les méthodes et les réactifs nécessaires pour effectuer l’hybridation de l’hybridation de l’ARN en fluorescence sur montage entier (HCR ARN, WM-FISH) afin de révéler des informations sur la résolution spatiale et cellulaire des gènes des récepteurs chimiosensoriels dans l’antenne du moustique et le palpe maxillaire.
Abstract
Les moustiques sont des vecteurs efficaces de maladies mortelles et peuvent naviguer dans leur environnement chimique à l’aide de récepteurs chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs. Comprendre comment les récepteurs chimiosensoriels sont organisés spatialement dans les appendices olfactifs périphériques peut offrir des informations sur la façon dont l’odeur est codée dans le système olfactif des moustiques et éclairer de nouvelles façons de lutter contre la propagation des maladies transmises par les moustiques. L’émergence de l’hybridation in situ de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) permet une cartographie spatiale et un profilage simultané de l’expression de plusieurs gènes chimiosensoriels. Ici, nous décrivons une approche par étapes pour effectuer l’ARN HCR WM-FISH sur l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire. Nous avons étudié la sensibilité de cette technique en examinant le profil d’expression des récepteurs olfactifs ionotropiques. Nous avons demandé si la technique HCR WM-FISH décrite était adaptée aux études multiplexées en attachant des sondes d’ARN à trois fluorophores spectralement distincts. Les résultats ont fourni la preuve que l’ARN HCR WM-FISH est robuste pour détecter simultanément plusieurs gènes chimiosensoriels dans l’antenne et les appendices olfactifs des palpes maxillaires. D’autres études attestent de l’adéquation de HCR WM-FISH pour le profilage de co-expression de cibles à ARN double et triple. Cette technique, lorsqu’elle est appliquée avec des modifications, pourrait être adaptable pour localiser des gènes d’intérêt dans les tissus olfactifs d’autres espèces d’insectes ou dans d’autres appendices.
Introduction
Les moustiques vecteurs tels que Anopheles gambiae s’appuient sur un riche répertoire de gènes chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs périphériques pour prospérer dans un monde chimique complexe et identifier les odeurs comportementales pertinentes émanant d’hôtes humains, détecter les sources de nectar et localiser les sites de ponte1. L’antenne du moustique et le palpe maxillaire sont enrichis de gènes chimiosensoriels qui pilotent la détection des odeurs dans ces appendices olfactifs. Trois classes principales de canaux ioniques ligand-dépendants pilotent la détection des odeurs dans les appendices olfactifs des moustiques : les récepteurs odorants (OR), qui fonctionnent avec un corécepteur obligatoire des récepteurs odorants (Orco) ; les récepteurs ionotropiques (IR), qui interagissent avec un ou plusieurs corécepteurs IR (IR8a, IR25a et IR76b) ; les récepteurs gustatifs chimiosensoriels (GRs), qui fonctionnent comme un complexe de trois protéines pour détecter le dioxyde de carbone (CO2)1,2.
L’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN est un outil puissant pour détecter l’expression de l’ARNm3 endogène. En général, cette méthode utilise une sonde d’acide nucléique simple brin marquée au fluorophore avec une séquence complémentaire à un ARNm cible. La liaison de la sonde d’ARN fluorescent à l’ARN cible permet d’identifier les cellules exprimant un transcrit d’intérêt. Des progrès récents permettent maintenant la détection de transcrits dans des tissus de moustiques entiers 4,5. La première génération de la technologie de réaction en chaîne par hybridation (HCR) utilisait un amplificateur HCR à base d’ARN ; cela a été amélioré dans une méthode de deuxième génération qui a plutôt utilisé de l’ADN artificiel pour l’amplificateur HCR 6,7. Cette mise à niveau s’est traduite par une multiplication par 10 du signal, une diminution spectaculaire des coûts de production et une amélioration significative de la durabilité des réactifs 6,7.
Dans le protocole, nous décrivons l’utilisation d’une méthode d’hybridation in situ par fluorescence d’ARN à montage entier HCR de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) conçue pour détecter la localisation spatiale et l’expression de tout gène 8,9. Cette méthode en deux étapes utilise d’abord des sondes d’acides nucléiques spécifiques à l’ARNm d’intérêt, mais qui contiennent également une séquence de reconnaissance de l’initiateur ; la deuxième étape utilise des épingles à cheveux marquées au fluorophore qui se lient à la séquence d’initiateur pour amplifier le signal fluorescent (Figure 1). Cette méthode permet également le multiplexage de deux ou plusieurs sondes d’ARN et l’amplification des signaux de sonde pour faciliter la détection et la quantification de l’ARN8. La visualisation de l’abondance des transcrits et des modèles de localisation de l’ARN des gènes chimiosensoriels exprimés dans les appendices olfactifs offre la première ligne de compréhension des fonctions des gènes chimiosensoriels et du codage des odeurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
La troisième génération de réaction en chaîne d’hybridation (HCR) est remarquable par sa sensibilité et sa robustesse pour visualiser plusieurs cibles d’ARN8. HCR WM-FISH a été utilisé avec succès sur les embryons de drosophile, de poulet, de souris et de poisson-zèbre ainsi que sur les larves de nématodes et de poissons-zèbres 10,16,17. Les antennes de moustiques et les palpes m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Margo Herre et le laboratoire de Leslie Vosshall d’avoir partagé leur protocole d’hybridation in-situ pour les appendices olfactifs d’Aedes aegypti . Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health à C.J.P. (NIAID R01Al137078), une bourse HHMI Hanna Gray à J.I.R, une bourse Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator à J.I.R, et une bourse postdoctorale de l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins à J.I.R. Nous remercions l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins et Bloomberg Philanthropies pour leur soutien.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
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