Reazione a catena di ibridazione RNA Fluorescenza a montaggio intero Ibridazione in situ di geni chemiosensoriali nelle appendici olfattive delle zanzare
Summary
L’articolo descrive i metodi e i reagenti necessari per eseguire la reazione a catena di ibridazione RNA a fluorescenza intera in situ (HCR, RNA, WM-FISH) per rivelare informazioni sulla risoluzione spaziale e cellulare dei geni dei recettori chemiosensoriali nell’antenna della zanzara e nel palpo mascellare.
Abstract
Le zanzare sono vettori efficaci di malattie mortali e possono navigare nel loro ambiente chimico utilizzando recettori chemiosensoriali espressi nelle loro appendici olfattive. Capire come i recettori chemiosensoriali sono organizzati spazialmente nelle appendici olfattive periferiche può offrire informazioni su come l’odore è codificato nel sistema olfattivo delle zanzare e informare nuovi modi per combattere la diffusione delle malattie trasmesse dalle zanzare. L’emergere della reazione a catena di ibridazione di terza generazione, l’ibridazione in situ dell’RNA a fluorescenza a montaggio intero (HCR, RNA, WM-FISH) consente la mappatura spaziale e la profilazione simultanea dell’espressione di più geni chemiosensoriali. Qui, descriviamo un approccio graduale per l’esecuzione dell’HCR RNA WM-FISH sull’antenna della zanzara Anopheles e sul palpo mascellare. Abbiamo studiato la sensibilità di questa tecnica esaminando il profilo di espressione dei recettori olfattivi ionotropici. Abbiamo chiesto se la tecnica HCR WM-FISH descritta fosse adatta per studi multiplexati legando sonde di RNA a tre fluorofori spettralmente distinti. I risultati hanno fornito la prova che HCR RNA WM-FISH è robustamente sensibile per rilevare simultaneamente più geni chemiosensoriali nell’antenna e nelle appendici olfattive palpi mascellari. Ulteriori indagini attestano l’idoneità di HCR WM-FISH per la profilazione di co-espressione di bersagli a doppio e triplo RNA. Questa tecnica, se applicata con modifiche, potrebbe essere adattabile per localizzare geni di interesse nei tessuti olfattivi di altre specie di insetti o in altre appendici.
Introduction
Le zanzare vettori come Anopheles gambiae si basano su un ricco repertorio di geni chemiosensoriali espressi nelle loro appendici olfattive periferiche per prosperare in un mondo chimico complesso e identificare odori rilevanti dal punto di vista comportamentale provenienti da ospiti umani, rilevare fonti di nettare e localizzaresiti di ovideposizione. L’antenna della zanzara e il palpo mascellare sono arricchiti con geni chemiosensoriali che guidano il rilevamento degli odori in queste appendici olfattive. Tre classi principali di canali ionici ligando-dipendenti guidano il rilevamento degli odori nelle appendici olfattive delle zanzare: i recettori degli odori (OR), che funzionano con un co-recettore obbligato del recettore degli odori (Orco); i recettori ionotropici (IR), che interagiscono con uno o più corecettori IR (IR8a, IR25a e IR76b); i recettori gustativi chemiosensoriali (GR), che funzionano come un complesso di tre proteine per rilevare l’anidride carbonica (CO2 2)1,2.
L’ibridazione in situ a fluorescenza dell’RNA è un potente strumento per rilevare l’espressione dell’mRNAendogeno 3. In generale, questo metodo utilizza una sonda di acido nucleico a singolo filamento marcata con fluorofori con sequenza complementare a un mRNA bersaglio. Il legame della sonda di RNA fluorescente all’RNA bersaglio consente l’identificazione di cellule che esprimono un trascritto di interesse. I recenti progressi consentono ora di rilevare le trascrizioni nei tessuti delle zanzare a montaggio intero 4,5. La prima generazione di tecnologia di reazione a catena di ibridazione (HCR) utilizzava un amplificatore HCR basato sull’RNA; questo è stato migliorato in un metodo di seconda generazione che ha invece utilizzato DNA ingegnerizzato per l’amplificatore HCR 6,7. Questo aggiornamento ha comportato un aumento di 10 volte del segnale, una drastica diminuzione dei costi di produzione e un miglioramento significativo della durata dei reagenti 6,7.
Nel protocollo, descriviamo l’utilizzo di un metodo di ibridazione in situ a fluorescenza dell’RNA a montaggio intero HCR di terza generazione (HCR RNA WM-FISH) progettato per rilevare la localizzazione spaziale e l’espressione di qualsiasi gene 8,9. Questo metodo in due fasi utilizza innanzitutto sonde di acido nucleico specifiche per l’mRNA di interesse, ma che contengono anche una sequenza di riconoscimento dell’iniziatore; la seconda fase utilizza forcine marcate con fluorofori che si legano alla sequenza dell’iniziatore per amplificare il segnale fluorescente (Figura 1). Questo metodo consente anche il multiplexing di due o più sonde di RNA e l’amplificazione dei segnali della sonda per facilitare il rilevamento e la quantificazione dell’RNA8. La visualizzazione dell’abbondanza del trascritto e dei modelli di localizzazione dell’RNA dei geni chemiosensoriali espressi nelle appendici olfattive offre la prima linea di comprensione delle funzioni dei geni chemiosensoriali e della codifica degli odori.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terza generazione di reazione a catena di ibridazione (HCR) è notevole per la sua sensibilità e robustezza nel visualizzare diversi bersagli di RNA8. HCR WM-FISH è stato utilizzato con successo su embrioni di Drosophila, polli, topi e zebrafish, nonché sulle larve di nematodi e zebrafish 10,16,17. Le antenne delle zanzare e i palpi mascellari sono in genere soggetti a un’elevata autofluore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Margo Herre e il laboratorio Leslie Vosshall per aver condiviso il loro protocollo di ibridazione in situ per le appendici olfattive di Aedes aegypti . Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health a C.J.P. (NIAID R01Al137078), da una borsa di studio HHMI Hanna Gray a J.I.R, da un Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award a J.I.R. e da una borsa di studio post-dottorato del Johns Hopkins Malaria Research Institute a J.I.R. Ringraziamo il Johns Hopkins Malaria Research Institute e Bloomberg Philanthropies per il loro sostegno.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
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