ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 蚊の嗅覚付属器における化学感覚遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション
Summary
本稿では、ハイブリダイゼーション、連鎖反応、RNA、ホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)を行い、蚊の触角と上顎触覚における化学感覚受容体遺伝子の空間的および細胞的分解能に関する洞察を明らかにするために必要な方法と試薬について説明します。
Abstract
蚊は致命的な病気の効果的な媒介者であり、嗅覚付属器に発現する化学感覚受容体を使用して化学的環境をナビゲートできます。化学感覚受容体が末梢嗅覚付属器官で空間的にどのように組織化されているかを理解することは、蚊の嗅覚系で匂いがどのようにコード化されているかについての洞察を提供し、蚊が媒介する病気の蔓延に対抗する新しい方法を知らせることができます。第3世代ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)の出現により、複数の化学感覚遺伝子の空間マッピングと同時発現プロファイリングが可能になります。ここでは、 ハマダラカ の蚊の触角と上顎触覚でHCR RNA WM-FISHを実行するための段階的なアプローチについて説明します。我々は、イオン性嗅覚受容体の発現プロファイルを調べることにより、この手法の感度を調べました。記載されたHCR WM-FISH法が、スペクトル的に異なる3つの蛍光色素にRNAプローブをつなぎ合わせたマルチプレックス研究に適しているかどうかを尋ねました。その結果、HCR RNA WM-FISHは、触角と上顎触覚嗅覚付属器の複数の化学感覚遺伝子を同時に検出する堅牢性を示す証拠が得られました。さらなる調査により、HCR WM-FISHが二重および三重RNAターゲットの共発現プロファイリングに適していることが証明されています。この手法を改変して適用すると、他の昆虫種の嗅覚組織や他の付属肢の目的の遺伝子を局在化するために適応できる可能性があります。
Introduction
ガンビエハマダラカなどの媒介蚊は、末梢の嗅覚付属器官に発現する化学感覚遺伝子の豊富なレパートリーに依存して、複雑な化学的世界で繁栄し、ヒトの宿主から発せられる行動に関連する匂いを識別し、蜜源を検出し、産卵部位を特定します1。蚊の触角と上顎触覚には、これらの嗅覚付属器の匂い検出を駆動する化学感覚遺伝子が豊富に含まれています。蚊の嗅覚付属器の匂い検出を駆動するリガンド依存性イオンチャネルの3つの主要なクラス:必須の匂い受容体共受容体(ORCO)で機能する匂い受容体(OR)。1つ以上のIRコレセプター(IR8a、IR25a、およびIR76b)と相互作用するイオノトロピック受容体(IR)。化学感覚味覚受容体(GR)は、二酸化炭素(CO2)を検出するための3つのタンパク質の複合体として機能します1,2。
RNA蛍光in situハイブリダイゼーションは、内因性mRNAの発現を検出するための強力なツールです3。一般に、この方法は、標的mRNAと相補的な配列を持つ蛍光色素タグ付き一本鎖核酸プローブを利用します。蛍光RNAプローブを標的RNAに結合させることで、目的の転写産物を発現する細胞を同定することができます。最近の進歩により、蚊の組織全体から転写産物を検出できるようになりました4,5。第1世代のハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)技術では、RNAベースのHCR増幅器が使用されました。これは、HCR増幅器6,7に人工DNAを使用する第2世代の方法で改良されました。このアップグレードにより、シグナルが10倍に増加し、製造コストが劇的に低下し、試薬の耐久性が大幅に向上しました6,7。
プロトコルでは、私達はあらゆる遺伝子8,9の空間的な局在そして表現を検出するために設計されている第3世代HCRのホールマウントRNAの蛍光性その場の交配(HCR RNA WM-FISH)方法の利用を記述する。この2段階の方法は、まず、目的のmRNAに特異的であるが、イニシエーター認識配列も含む核酸プローブを利用します。第2ステップでは、イニシエーター配列に結合する蛍光色素タグ付きヘアピンを利用して蛍光シグナルを増幅します(図1)。また、この方法では、2つ以上のRNAプローブの多重化およびプローブシグナルの増幅が可能になり、RNAの検出および定量が容易になる8。嗅覚付属器に発現する化学感覚遺伝子の転写産物量とRNA局在パターンを可視化することで、化学感覚遺伝子の機能と匂いのコーディングに関する最初の洞察が得られます。
Protocol
Representative Results
Discussion
第3世代のハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)は、いくつかのRNA標的を可視化する感度と頑健性で注目に値します8。HCR WM-FISHは、ショウジョウバエ、ニワトリ、マウス、ゼブラフィッシュの胚、線虫やゼブラフィッシュの幼虫に使用されています10,16,17。蚊の触角と上顎触角は、通常、自家蛍光が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ネ ッタイシマカ の嗅覚付属器のin-situハイブリダイゼーションプロトコルを共有してくれたMargo Herre氏とLeslie Voshall研究室に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIAID R01Al137078)からC.J.P.への助成金、J.I.R.へのHHMIハンナ・グレイ・フェローシップ、J.I.R.へのジョンズ・ホプキンス博士研究員アクセラレーター賞、J.I.R.へのジョンズ・ホプキンス・マラリア研究所ポスドク・フェローシップによって支援されました。ジョンズ・ホプキンス大学マラリア研究所とブルームバーグ・フィランソロピーズのご支援に感謝いたします。
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
