Hybridiseringskjedereaksjon RNA Helmontert fluorescens in situ hybridisering av kjemosensoriske gener i myggluktvedheng
Summary
Artikkelen beskriver metodene og reagensene som er nødvendige for å utføre hybridiseringskjedereaksjon RNA helmontert fluorescens in situ hybridisering (HCR, RNA, WM-FISH) for å avsløre innsikt i romlig og cellulær oppløsning av kjemosensoriske reseptorgener i myggantenne og maksillærpalp.
Abstract
Mygg er effektive vektorer av dødelige sykdommer og kan navigere i sitt kjemiske miljø ved hjelp av kjemosensoriske reseptorer uttrykt i deres olfaktoriske vedlegg. Å forstå hvordan kjemosensoriske reseptorer er romlig organisert i de perifere olfaktoriske vedleggene, kan gi innsikt i hvordan lukt er kodet i myggluktsystemet og informere om nye måter å bekjempe spredning av myggbårne sykdommer. Fremveksten av tredje generasjons hybridiseringskjedereaksjon RNA helmontert fluorescens in situ hybridisering (HCR, RNA, WM-FISH) muliggjør romlig kartlegging og samtidig ekspresjonsprofilering av flere kjemosensoriske gener. Her beskriver vi en trinnvis tilnærming for å utføre HCR RNA WM-FISH på Anopheles myggantenne og maksillærpalp. Vi undersøkte sensitiviteten til denne teknikken ved å undersøke ekspresjonsprofilen til ionotrope olfaktoriske reseptorer. Vi spurte om den beskrevne HCR WM-FISH-teknikken var egnet for multipleksede studier ved å binde RNA-sonder til tre spektralt distinkte fluoroforer. Resultatene ga bevis for at HCR RNA WM-FISH er robust følsom for samtidig å oppdage flere kjemosensoriske gener i antennen og maxillarpalp olfaktoriske vedheng. Videre undersøkelser vitner om egnetheten til HCR WM-FISH for co-expression profilering av doble og triple RNA-mål. Denne teknikken, når den brukes med modifikasjoner, kan tilpasses for å lokalisere gener av interesse i det olfaktoriske vevet til andre insektarter eller i andre vedlegg.
Introduction
Myggvektorer som Anopheles gambiae stole på et rikt repertoar av kjemosensoriske gener uttrykt i deres perifere olfaktoriske vedheng for å trives i en kompleks kjemisk verden og identifisere atferdsmessig relevante lukt som kommer fra menneskelige verter, oppdage nektarkilder og lokalisere oviposisjonssteder1. Myggantennen og den maksillære palpen er beriket med kjemosensoriske gener som driver luktdeteksjon i disse olfaktoriske vedleggene. Tre hovedklasser av ligandstyrte ionekanaler driver luktdeteksjon i myggens olfaktoriske vedheng: Odorantreseptorene (OR), som fungerer med en obligatorisk Odorantreseptor-co-reseptor (Orco); de ionotrope reseptorene (IR), som interagerer med en eller flere IR-koreseptorer (IR8a, IR25a og IR76b); de kjemosensoriske gustatoriske reseptorene (GRs), som fungerer som et kompleks av tre proteiner for å oppdage karbondioksid (CO2) 1,2.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering er et kraftig verktøy for å oppdage uttrykket av endogent mRNA3. Generelt benytter denne metoden en fluoroformerket enkeltstrenget nukleinsyresonde med sekvens komplementær til et mål-mRNA. Binding av den fluorescerende RNA-sonden til mål-RNA tillater identifisering av celler som uttrykker et transkripsjon av interesse. Nylige fremskritt gjør det nå mulig å oppdage transkripsjoner i helmonterte myggvev 4,5. Den første generasjonen av hybridiseringskjedereaksjonsteknologi (HCR) brukte en RNA-basert HCR-forsterker; Dette ble forbedret i en andregenerasjons metode som i stedet brukte konstruert DNA for HCR-forsterkeren 6,7. Denne oppgraderingen resulterte i en 10x økning i signal, en dramatisk reduksjon i produksjonskostnadene og betydelig forbedring i holdbarheten til reagenser 6,7.
I protokollen beskriver vi bruken av en tredje generasjons HCR helmontert RNA-fluorescens in situ hybridisering (HCR RNA WM-FISH) metode designet for å oppdage romlig lokalisering og ekspresjon av et hvilket som helst gen 8,9. Denne to-trinns metoden bruker først nukleinsyreprober som er spesifikke for mRNA av interesse, men som også inneholder en initiatorgjenkjenningssekvens; Det andre trinnet benytter fluoroformerkede hårnåler som binder seg til initiatorsekvensen for å forsterke det fluorescerende signalet (figur 1). Denne metoden tillater også multipleksing av to eller flere RNA-prober og forsterkende sondesignaler for å lette RNA-deteksjon og kvantifisering8. Visualisering av transkripsjonsoverflod og RNA-lokaliseringsmønstre av kjemosensoriske gener uttrykt i olfaktoriske vedlegg gir den første innsikten i kjemosensoriske genfunksjoner og luktkoding.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den tredje generasjonen av hybridiseringskjedereaksjon (HCR) er bemerkelsesverdig for sin følsomhet og robusthet for å visualisere flere RNA-mål8. HCR WM-FISH har blitt brukt med hell på embryoene til Drosophila, kylling, mus og sebrafisk samt larver av nematoder og sebrafisk 10,16,17. Myggantenner og maksillære palper er typisk utsatt for høy autofluorescens og svak sondepenetrasjon, noe s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Margo Herre og Leslie Vosshall lab for å dele deres in situ hybridiseringsprotokoll for Aedes aegypti olfaktoriske vedheng. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health til CJP (NIAID R01Al137078), et HHMI Hanna Gray-fellesskap til JIR, en Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award til JIR, og et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship til JIR Vi takker Johns Hopkins Malaria Research Institute og Bloomberg Philanthropies for deres støtte.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
