Гибридизация Цепная реакция РНК Флуоресценция in situ Гибридизация хемосенсорных генов в обонятельных придатках комаров
Summary
В статье описаны методы и реагенты, необходимые для проведения гибридизации цепной реакции РНК флуоресценции in situ (HCR RNA WM-FISH) для получения информации о пространственном и клеточном разрешении генов хемосенсорных рецепторов в антенне комара и верхнечелюстных пальпах.
Abstract
Комары являются эффективными переносчиками смертельных болезней и могут ориентироваться в химической среде с помощью хемосенсорных рецепторов, экспрессируемых в их обонятельных придатках. Понимание того, как хемосенсорные рецепторы пространственно организованы в периферических обонятельных придатках, может дать представление о том, как запах кодируется в обонятельной системе комаров, и проинформировать о новых способах борьбы с распространением заболеваний, переносимых комарами. Появление гибридизации цепной реакции РНК с флуоресценцией in situ (HCR RNA WM-FISH) позволяет осуществлять пространственное картирование и одновременное профилирование экспрессии нескольких хемосенсорных генов. В данной статье мы опишем поэтапный подход к выполнению HCR РНК WM-FISH на антенне комаров Anopheles и верхнечелюстных пальпах. Мы исследовали чувствительность этой методики, изучив профиль экспрессии ионотропных обонятельных рецепторов. Мы спросили, подходит ли описанная техника HCR WM-FISH для мультиплексных исследований путем привязки РНК-зондов к трем спектрально различным флуорофорам. Полученные результаты свидетельствуют о том, что HCR РНК WM-FISH обладает высокой чувствительностью к одновременному обнаружению нескольких хемосенсорных генов в антенне и верхнечелюстных пальпированных обонятельных придатках. Дальнейшие исследования подтверждают пригодность HCR WM-FISH для профилирования коэкспрессии мишеней с двойной и тройной РНК. Этот метод, применяемый с модификациями, может быть адаптирован для локализации интересующих генов в обонятельных тканях других видов насекомых или в других придатках.
Introduction
Комары-переносчики, такие как Anopheles gambiae, полагаются на богатый репертуар хемосенсорных генов, экспрессируемых в их периферических обонятельных придатках, чтобы процветать в сложном химическом мире и идентифицировать поведенчески значимые запахи, исходящие от людей-хозяев, обнаруживать источники нектара и находитьместа яйцекладки. Антенна комара и верхнечелюстные щупики обогащены хемосенсорными генами, которые управляют обнаружением запаха в этих обонятельных придатках. Три основных класса лиганд-зависимых ионных каналов управляют обнаружением запаха в обонятельных придатках комаров: рецепторы одоранта (OR), которые функционируют с облигатным корецептором рецептора одоранта (Orco); ионотропные рецепторы (ИК), которые взаимодействуют с одним или несколькими ИК-корецепторами (IR8a, IR25a и IR76b); хемосенсорные вкусовые рецепторы (ГР), которые функционируют как комплекс из трех белков для обнаружения углекислого газа (CO2)1,2.
Флуоресцентная гибридизация РНК in situ является мощным инструментом для обнаружения экспрессии эндогенной мРНК3. Как правило, в этом методе используется меченый флуорофором одноцепочечный зонд нуклеиновой кислоты с последовательностью, комплементарной мРНК-мишени. Связывание флуоресцентного РНК-зонда с РНК-мишеней позволяет идентифицировать клетки, экспрессирующие интересующий нас транскрипт. Последние достижения в настоящее время позволяют обнаруживать транскрипты в целых тканях комаров 4,5. В первом поколении технологии гибридизационной цепной реакции (HCR) использовался HCR-амплификатор на основе РНК; Это было улучшено в методе второго поколения, в котором вместо этого использовалась сконструированная ДНК для HCR-амплификатора 6,7. Эта модернизация привела к 10-кратному увеличению сигнала, резкому снижению себестоимости производства и значительному улучшению стойкости реагентов 6,7.
В протоколе описывается использование метода флуоресценции РНК in situ третьего поколения HCR (HCR RNA WM-FISH), предназначенного для определения пространственной локализации и экспрессии любого гена 8,9. В этом двухэтапном методе сначала используются зонды нуклеиновых кислот, специфичные для интересующей мРНК, но которые также содержат последовательность узнавания инициаторов; на втором этапе используются меченые флуорофором шпильки, которые связываются с последовательностью инициатора для усиления флуоресцентного сигнала (рис. 1). Этот метод также позволяет мультиплексировать два или более РНК-зондов и усиливать сигналы зондов для облегчения обнаружения и количественного определения РНК8. Визуализация обилия транскриптов и паттернов локализации РНК хемосенсорных генов, экспрессируемых в обонятельных придатках, дает первое представление о функциях хемосенсорных генов и кодировании запахов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Третье поколение гибридизационной цепной реакции (ГЦР) отличается чувствительностью и надежностью для визуализации нескольких мишеней РНК8. HCR WM-FISH был успешно применен на эмбрионах дрозофилы, курицы, мыши и рыбки данио, а также на личинках нематод и рыбок данио-рерио<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Марго Херре (Margo Herre) и лабораторию Лесли Восшалла (Leslie Voshall) за то, что они поделились своим протоколом гибридизации in situ для обонятельных придатков Aedes aegypti . Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения для C.J.P. (NIAID R01Al137078), стипендией HHMI Ханны Грей для J.I.R., премией Джонса Хопкинса для постдокторантуры J.I.R. и постдокторской стипендией Института исследования малярии Джонса Хопкинса для J.I.R. Мы благодарим Научно-исследовательский институт малярии Университета Джонса Хопкинса и Благотворительный фонд Блумберга за поддержку.
Materials
| Amplification buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 50 mL |
| Calcium Chloride (CaCl2) 1M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsin | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf tube | VWR | 20901-551 | 1.5 mL |
| Forceps | Dumont | 11251 | Number 5 |
| Gel loading tip | Costar | 4853 | 1-200 µL tip |
| Hairpins | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | h1 and h2 initiator splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| IR25a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK149 | AGAP010272 |
| IR41t.1 probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK978 | AGAP004432 |
| IR64a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK700 | AGAP004923 |
| IR75d probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK976 | AGAP004969 |
| IR76b probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRI998 | AGAP011968 |
| IR7t probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRL355 | AGAP002763 |
| IR8a probe | Molecular Instruments | Probe Set ID: PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes |
| Magnessium Chloride (MgCl2) 1M | Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher | A412-500 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini rocker |
| Orco probe | Molecular Instruments | Probe set ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldehyde (20% ) | Electron Microscopy Services | 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Probe hybridization buffer | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Probe wash buffer | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher | S36972 | mounting solution |
| Sodium Chloride (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 (10%) | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tween-20 (10% ) | Teknova | T0027 | |
| Watch glass | Carolina | 742300 | 1 5/8" square; transparent |
References
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
- Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
- Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
- Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
- Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
- Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
- Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
- Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
- Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
- Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
- Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
- Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
- Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
- Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
- Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
