नाक म्यूकोसा ऊतक वर्गों में इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग बहुरंगा इम्यूनोसे के माध्यम से एलर्जिक राइनाइटिस चूहों के खंड
Summary
यह प्रोटोकॉल एलर्जिक राइनाइटिस के चूहे के मॉडल के मूल्यांकन के लिए एक बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का वर्णन करता है।
Abstract
एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) नाक के श्लेष्म की एक पुरानी, गैर-संक्रामक सूजन की बीमारी है, जो मुख्य रूप से विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो दुनिया की आबादी का लगभग 10% -20% प्रभावित करती है। जबकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला लंबे समय से रोग-विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक मानक तकनीक है, पारंपरिक आईएफ तकनीक एक ही नमूने में तीन या अधिक प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाने की उनकी क्षमता में सीमित हैं। नतीजतन, हाल के वर्षों में बहुरंगा आईएफ तकनीक विकसित की गई है, जो कोशिकाओं या ऊतकों में कई लक्ष्यों के एक साथ लेबलिंग की अनुमति देती है।
यह प्रोटोकॉल एआर के चूहे के मॉडल की स्थापना, नाक के श्लेष्म नमूने प्राप्त करने और बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए तकनीकी प्रक्रियाओं के लिए प्रक्रिया का एक व्यापक अवलोकन प्रदान करता है। एआर समूह के सभी चूहों ने छींकने, एक बहती नाक और एक खुजली वाली नाक जैसे विशिष्ट लक्षणों का प्रदर्शन किया, जिसमें व्यवहार संबंधी टिप्पणियों ने ≥5 अंक हासिल किए। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला होने से पता चला कि एआर समूह में भड़काऊ सेल काउंट में वृद्धि हुई है और नाक म्यूकोसल अखंडता बाधित हुई है। बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एमआईएफ) ने आरओआर और टीआईसीएएम -1 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जबकि एआर चूहों के नाक म्यूकोसा ऊतक में फॉक्सपी 3 अभिव्यक्ति में कमी आई।
Introduction
एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) नाक के श्लेष्म की एक पुरानी, गैर-संक्रामक सूजन की बीमारी है जो मुख्य रूप से विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई)1,2द्वारा मध्यस्थता की जाती है। यह छींकने, नाक बहने, नाक बंद होने और नाक की खुजली जैसे लक्षणों की विशेषता है। औद्योगीकरण और शहरीकरण के साथ, एआर का प्रसार धीरे-धीरे बढ़ रहा है, जिससे दुनियाकी आबादी का लगभग 10% -20% प्रभावित होता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) तकनीक एक फ्लोरोसेंट धुंधला विधि है जो एंटीबॉडी-एंटीजन बाध्यकारी प्रतिक्रिया का उपयोग करती है। यह जैविक ऊतकों या कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन के वितरण और अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एआर अनुसंधान में, आईएफ एक साथ एआर से संबंधित साइटोकिन्स, भड़काऊ कोशिकाओं, रिसेप्टर्स, और अधिक सहित कई लक्ष्यों का पता लगा सकता है, जिससे एआर रोगजनन की खोज औरदवाओं के प्रभाव 3,4,5,6 की सुविधा मिलती है।
बहुरंगा immunofluorescence (एमआईएफ) धुंधला हो जाना प्रक्रिया बारीकी से धुंधला हो जाना के प्रत्येक दौर के दौरान एक एंटीबॉडी क्षालन कदम के अलावा पारंपरिक अगर जैसा दिखता है. यह संशोधन अनुक्रमिक एकल-लेबलिंग और पुन: धुंधला होने के कई दौरों के माध्यम से एक ही ऊतक अनुभाग पर कई बायोमार्कर का एक साथ पता लगाने में सक्षम बनाता है। एमआईएफ टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) पर आधारित है, टीएसए फ्लोरोसेंट धुंधला के दोहराया चक्र और फ्लोरोसेंटसंकेतों को बनाए रखते हुए एंटीबॉडी को हटाने के लिए माइक्रोवेव हीटिंग के उपयोग की अनुमति देता है 7,8. पारंपरिक आईएफ की तुलना में, एमआईएफ कई फायदे प्रदान करता है: (1) यह कमजोर रूप से व्यक्त एंटीजन का पता लगा सकता है जो पारंपरिक आईएफ 9,10 के साथ पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं; (2) यह एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ उच्च गुणवत्ता वाला धुंधला प्रदान करता है; (3) यह ऊतक-विशिष्ट संरचनाओं और ब्याज11 के क्षेत्रों की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है; (4) कई मार्गों को मल्टीप्लेक्सिंग कुशलतापूर्वक ऊतकों का उपयोग करता है और सीमित रोग संसाधनों का संरक्षण करता है12; (5) एमआईएफ के माध्यम से बहु-पैरामीटर विश्लेषण ऊतकों में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, छिपी हुई जैविक जानकारी को उजागर करता है13.
कुल मिलाकर, एमआईएफ एक ही नमूने के भीतर विभिन्न एंटीजन अभिव्यक्तियों और वितरण के अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे लक्ष्य प्रोटीन के अध्ययन की सुविधा मिलती है। भविष्य में, कई लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति और वितरण को समझने की मांग करने वाले शोधकर्ताओं को यह तकनीक एक मूल्यवान विकल्प मिलेगी। यह अध्ययन एआर के साथ चूहों से नाक के श्लेष्म के नमूनों को धुंधला करने के लिए एमआईएफ के आवेदन को प्रदर्शित करता है और एआर के चूहे मॉडल की स्थापना का मूल्यांकन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) नाक के श्लेष्म की एक गैर-संक्रामक सूजन की बीमारी है जो पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों के संयोजन से उत्पन्न होती है। यह एक वैश्विक स्वास्थ्य चिंता बन गई है, जो कार्य कुशलता को प्रभाव…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सिचुआन प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (2021YJ0175) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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