Marcação por Imunofluorescência em Cortes de Tecido da Mucosa Nasal de Ratos com Rinite Alérgica via Imunoensaio Multicolorido
Summary
Este protocolo descreve uma técnica de imunofluorescência multicolor para avaliação do modelo de rinite alérgica em ratos.
Abstract
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E específica (IgE), afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial. Enquanto a coloração por imunofluorescência (IF) tem sido uma técnica padrão para detectar a expressão de proteínas doença-específicas, as técnicas convencionais de FI são limitadas em sua capacidade de detectar os níveis de expressão de três ou mais proteínas na mesma amostra. Consequentemente, técnicas de FI multicolorido têm sido desenvolvidas nos últimos anos, que permitem a marcação simultânea de múltiplos alvos em células ou tecidos.
Este protocolo fornece uma visão abrangente do processo para o estabelecimento de um modelo de RA em ratos, obtenção de amostras de mucosa nasal e procedimentos técnicos para imunofluorescência multicolorida. Todos os ratos do grupo RA apresentaram sintomas típicos como espirros, coriza e coceira no nariz, com observações comportamentais pontuando ≥5 pontos. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou aumento da contagem de células inflamatórias e integridade da mucosa nasal no grupo RA. A imunofluorescência multicolor (mIF) demonstrou aumento da expressão de RORγt e TICAM-1, enquanto a expressão de Foxp3 diminuiu no tecido da mucosa nasal de ratos RA.
Introduction
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crônica, não infecciosa, da mucosa nasal, mediada primariamente por imunoglobulina E (IgE) específica1,2. É caracterizada por sintomas como espirros, coriza, congestão nasal e prurido nasal. Com a industrialização e urbanização, a prevalência da RA vem aumentando gradativamente, afetando aproximadamente 10%-20% da população mundial1. A técnica de imunofluorescência (IF) é um método de coloração fluorescente que utiliza uma reação de ligação anticorpo-antígeno. Pode ser empregado para detectar e quantificar os níveis de distribuição e expressão de proteínas específicas em tecidos biológicos ou células. Na pesquisa de RA, o FI pode detectar simultaneamente múltiplos alvos, incluindo citocinas relacionadas à RA, células inflamatórias, receptores e muito mais, facilitando a exploração da patogênese da RA e dos efeitos de drogas 3,4,5,6.
O processo de coloração por imunofluorescência multicolor (mIF) se assemelha muito ao FI tradicional, com a adição de uma etapa de eluição de anticorpos durante cada rodada de coloração. Essa modificação permite a detecção simultânea de múltiplos biomarcadores na mesma seção de tecido por meio de marcação única sequencial e várias rodadas de recoloração. O mIF é baseado na amplificação do sinal da tiramida (TSA), permitindo ciclos repetidos de coloração fluorescente de TSA e o uso de aquecimento por micro-ondas para remover anticorpos enquanto retém sinais fluorescentes 7,8. Em comparação com o FI convencional, o mIF oferece várias vantagens: (1) pode detectar antígenos fracamente expressos que são difíceis de identificar com o IF convencional 9,10; (2) proporciona coloração de alta qualidade com melhor relação sinal-ruído; (3) permite quantificar estruturas tecido-específicas e regiões de interesse11; (4) a multiplexação de múltiplas vias utiliza tecidos de forma eficiente e conserva recursos patológicos limitados12; (5) a análise multiparamétrica por meio do mIF oferece informações mais profundas sobre os tecidos, revelando informações biológicas ocultas13.
De modo geral, o mIF permite a observação de diferentes expressões e distribuições de antígenos dentro de uma mesma amostra, facilitando o estudo das proteínas-alvo. No futuro, pesquisadores que buscam entender a expressão e distribuição de múltiplas proteínas-alvo encontrarão essa técnica como uma escolha valiosa. Este estudo demonstra a aplicação do mIF na coloração de amostras de mucosa nasal de ratos com RA e avalia o estabelecimento de um modelo de RA em ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória não infecciosa da mucosa nasal resultante de uma combinação de fatores ambientais e genéticos. Tornou-se um problema de saúde global, impactando a eficiência do trabalho, diminuindo a qualidade de vida, prejudicando o sono, a função cognitiva e causando irritabilidade e fadiga. A RA afeta 10%-20% da população mundial¹ e acarreta custos econômicos substanciais, causando perdas anuais de até 30-50 bilhões de euros nos países da UE18…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2021YJ0175).
Materials
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue – a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95 (2020).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
