Hurtig og effektiv berigelse af musens rygmarvsmikroglia
Summary
Microglia betragtes som nogle af de mest alsidige celler i kroppen, der er i stand til morfologisk og funktionel tilpasning. Deres heterogenitet og multifunktionalitet muliggør vedligeholdelse af hjernehomeostase, samtidig med at de er forbundet med forskellige neurologiske patologier. Her beskrives en teknik til rensning af rygmarvsmikroglia.
Abstract
Rygsøjlen definerer et hvirveldyr og former rygmarvskanalen, et hulrum, der omslutter og beskytter rygmarven. Korrekt udvikling og funktion af pattedyrs centralnervesystem er signifikant afhængig af aktiviteten af residente makrofager kendt som microglia. Microglia viser heterogenitet og multifunktionalitet, hvilket muliggør tydelig genekspression og adfærd i rygmarven og hjernen. Talrige undersøgelser har undersøgt cerebral mikroglia funktion, beskriver rensningsmetoder i vid udstrækning. Imidlertid mangler oprensningen af microglia fra rygmarven hos mus en omfattende beskrivelse. I modsætning hertil mangler udnyttelsen af en højt oprenset collagenase, i modsætning til et uraffineret ekstrakt, rapportering inden for centralnervesystemets væv. I denne undersøgelse blev rygsøjlen og rygmarven udskåret fra 8-10 uger gamle C57BL/6-mus. Efterfølgende fordøjelse anvendte en højt oprenset collagenase, og mikroglia-oprensning udnyttede en densitetsgradient. Celler gennemgik farvning for flowcytometri og vurderede levedygtighed og renhed gennem CD11b- og CD45-farvning. Resultaterne gav en gennemsnitlig levedygtighed på 80% og en gennemsnitlig renhed på 95%. Afslutningsvis involverede manipulation af musemikroglia fordøjelse med en højt oprenset collagenase, efterfulgt af en densitetsgradient. Denne tilgang producerede effektivt betydelige rygmarvsmikrogliapopulationer.
Introduction
Det definerende kendetegn ved hvirveldyr er rygsøjlen eller rygsøjlen, hvor notokordet er blevet erstattet af en sekvens af segmenterede knogler kaldet hvirvler, divideret med intervertebrale diske. Denne række af osseøst materiale former rygmarvskanalen, et hulrum, der omslutter og beskytter rygmarven1. I slægten Rodentia dannes rygsøjlen normalt af syv halshvirvler, tretten brysthvirvler, seks lændehvirvler og et variabelt antal kaudale hvirvler 2,3. Rygmarvens længde svarer til rygsøjlens, og den terminale filum er en ikke-nervøs struktur, der forankrer rygmarven til korsbenet. Derudover går nervefibre ud gennem de intervertebrale foramen1.
Udviklingen og den korrekte funktion af centralnervesystemet hos pattedyr afhænger kritisk af aktiviteten af nervesystemets residente makrofager, kaldet microglia4. Selvom mikroglia oprindeligt blev beskrevet som hjerneboende fagocytter, har nyere forskning tilskrevet disse cellermange dynamiske funktioner 5,6. Microglias størrelse varierer fra 7 til 10 μm i homeostase; De betragtes som blandt de mest alsidige celler i kroppen og kan tilpasse sig morfologisk og funktionelt til deres konstant skiftende miljø7. Disse celler udviser høj heterogenitet i både embryonale og voksne stadier8,9, mens de i voksenstadiet også viser kompleks funktionel heterogenitet baseret på deres rumlige tidsmæssige kontekst10. Heterogeniteten og flere funktioner i microglia giver mulighed for differentiel genekspression og adfærd i rygmarven og hjernen. Det har vist sig, at CD11b, CD45, CD86 og CCR9 ekspression er højere i rygmarven sammenlignet med hjernen 8,9.
Der findes flere protokoller for cerebral mikrogliaisolering11,12; Der findes dog kun få for rygmarvsmikroglia13,14. Optimering af en metode til rensning af mikroglia fra rygmarven letter udviklingen af flere undersøgelser med fokus på at opdage mikrogliafysiologi. Denne protokol har til formål at beskrive en enkel og meget reproducerbar ekstraktion af musens rygmarv og rensning af mikroglia (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Talrige protokoller er blevet udviklet til undersøgelse af microglia på grund af deres betydning i hjernens homeostase. I disse metoder kommer mikroglia typisk fra hjernehalvkuglerne hos embryonale eller neonatale rotter og mus17. Et begrænset antal undersøgelser har behandlet oprensning af mikroglia fra rygmarven hos voksne mus13,14. Disse teknikker involverer enzymatisk fordøjelse ved hjælp af kollagenase og / eller papain sammen m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra stipendiet fra National Council of Science and Technology (CONACYT) (702361). Forfatterne anerkender ph.d. program i biologiske kemiske videnskaber fra National School of Biological Sciences af National Polytechnic Institute.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
References
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
