Rask og effektiv anrikning av mus ryggmargen microglia

Summary

Mikroglia regnes som noen av de mest allsidige cellene i kroppen, i stand til morfologisk og funksjonell tilpasning. Deres heterogenitet og multifunksjonalitet muliggjør vedlikehold av hjernens homeostase, samtidig som de er knyttet til ulike nevrologiske patologier. Her beskrives en teknikk for rensing av ryggmargsmikroglia.

Abstract

Virvelsøylen definerer et virveldyr og former ryggraden, et hulrom som omslutter og beskytter ryggmargen. Riktig utvikling og funksjon av pattedyrs sentralnervesystem er avhengig av aktiviteten til bosatt makrofager kjent som mikroglia. Mikroglia viser heterogenitet og multifunksjonalitet, noe som muliggjør distinkt genuttrykk og oppførsel i ryggmargen og hjernen. Tallrike studier har utforsket cerebral mikroglia-funksjon, og beskriver rensingsmetoder omfattende. Rensingen av mikroglia fra ryggmargen hos mus mangler imidlertid en omfattende beskrivelse. I motsetning til dette mangler bruken av en høyt renset kollagenase, i motsetning til et uraffinert ekstrakt, rapportering i vev i sentralnervesystemet. I denne studien ble virvelsøylen og ryggmargen skåret ut fra 8-10 uker gamle C57BL/6-mus. Påfølgende fordøyelse benyttet en svært renset kollagenase, og mikrogliarensing benyttet en tetthetsgradient. Cellene gjennomgikk farging for flowcytometri, og vurderte levedyktighet og renhet gjennom CD11b- og CD45-farging. Resultatene ga en gjennomsnittlig levedyktighet på 80% og en gjennomsnittlig renhet på 95%. Avslutningsvis involverte manipulering av musemikroglia fordøyelsen med en høyt renset kollagenase, etterfulgt av en tetthetsgradient. Denne tilnærmingen produserte effektivt betydelige ryggmargsmikrogliapopulasjoner.

Introduction

Den definerende egenskapen til vertebrater er vertebral kolonnen eller ryggraden, hvor notokordet er erstattet av en sekvens av segmenterte bein kalt ryggvirvler, delt med intervertebrale skiver. Denne rekkefølgen av osseous materiale former spinalkanalen, et hulrom som omslutter og beskytter ryggmargen¹. I slekten Rodentia er ryggraden vanligvis dannet av syv nakkevirvler, tretten thoraxvirvler, seks lumbale ryggvirvler og et variabelt antall kaudale ryggvirvler ^2,3. Lengden på ryggmargen er lik ryggraden, og det terminale filum er en ikke-nervøs struktur som forankrer ryggmargen til sakrummet. I tillegg går nervefibrene ut gjennom det intervertebrale foramen¹.

Utviklingen og riktig funksjon av sentralnervesystemet hos pattedyr er kritisk avhengig av aktiviteten til nervesystemets fastboende makrofager, kalt mikroglia⁴. Selv om mikroglia opprinnelig ble beskrevet som hjernebosatte fagocytter, har nyere forskning tilskrevet mange dynamiske funksjoner til disse cellene ^5,6. Microglias størrelse varierer fra 7 til 10 μm i homeostase; De regnes blant de mest allsidige cellene i kroppen og kan tilpasse seg morfologisk og funksjonelt til deres stadig skiftende miljø⁷. Disse cellene viser høy heterogenitet under både embryonale og voksne stadier^8,9, mens de i voksenstadiet også viser kompleks funksjonell heterogenitet basert på deres spatiotemporale kontekst¹⁰. Heterogeniteten og flere funksjoner av mikroglia tillater differensielt genuttrykk og oppførsel i ryggmargen og hjernen. Det har vist seg at CD11b, CD45, CD86 og CCR9-uttrykk er høyere i ryggmargen sammenlignet med hjernen ^8,9.

Det finnes flere protokoller for isolering av cerebral mikroglia^11,12; Imidlertid finnes det bare noen få for ryggmargsmikroglia^13,14. Optimalisering av en metode for rensing av mikroglia fra ryggmargen letter utviklingen av flere studier fokusert på å oppdage mikrogliafysiologi. Denne protokollen tar sikte på å beskrive en enkel og svært reproduserbar ekstraksjon av musens ryggmarg og rensing av mikroglia (figur 1).

Protocol

Studien ble utført i samsvar med den offisielle meksikanske standarden NOM-062-ZOO-1999 og veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr. Godkjenning for studien ble innhentet fra forsknings-, etikk- og biosikkerhetskomiteene ved Mexico Children’s Hospital (HIM/2023/006) og forsknings- og bioetikkkomiteen ved General Hospital of Mexico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre C57BL/6-mus i alderen 6 til 8 uker ble hentet fra Mexico Children’s Hospital, hvor de ble oppdratt under isolerte forhold i ventilerte stativer,…

Representative Results

Ved bruk av musryggmargsvev ble enzymatisk fordøyelse utført ved bruk av en blanding som var sterkt beriket med kollagenase og termolysin. Det resulterende fordøyde vevet gjennomgikk passasje gjennom et 40 μm filter for å eliminere ufordøyd materiale. De oppsamlede cellene ble anriket gjennom en Percoll-tetthetsgradient, med 90% i den nedre delen og 45% i den øvre delen. De mikrogliaberikede cellene i grenseflaten ble deretter farget med CD45- og CD11b-antistoffer og utsatt for flowcytometrisk analyse (<strong cla…

Discussion

Tallrike protokoller er utviklet for studier av mikroglia på grunn av deres betydning i hjernens homeostase. I disse metodene kommer mikroglia vanligvis fra hjernehalvdelene hos embryonale eller neonatale rotter og mus¹⁷. Et begrenset antall studier har adressert rensing av mikroglia fra ryggmargen hos voksne mus^13,14. Disse teknikkene involverer enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase og/eller papain sammen med DNAse, ofte kombine…

Materials

15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining