Realtidsbilleddannelse af akrosomal calciumdynamik og exocytose i levende musesæd
Summary
AcroSensE-musemodellen og levende cellebilleddannelsesmetoder, der er beskrevet her, giver en ny tilgang til at studere calciumdynamik i sædets subcellulære rum, og hvordan de regulerer mellemliggende trin, der fører til membranfusion og akrosomexocytose.
Abstract
Akrosomexocytose (AE), hvor sædcellernes enkelt exocytotiske vesikel smelter sammen med plasmamembranen, er en kompleks, calciumafhængig proces, der er afgørende for befrugtning. Vores forståelse af, hvordan calciumsignalering regulerer AE, er dog stadig ufuldstændig. Især er samspillet mellem intra-akrosomale calciumdynamikker og de mellemliggende trin, der fører til AE, ikke veldefineret. Her beskriver vi en metode, der giver rumlig og tidsmæssig indsigt i akrosomal calciumdynamik og deres forhold til membranfusion og efterfølgende exocytose af akrosomblæren. Metoden anvender en ny transgen mus, der udtrykker en Acrosome-målrettet sensor til exocytose (AcroSensE). Sensoren kombinerer en genetisk kodet calciumindikator (GCaMP) smeltet sammen med mCherry. Dette fusionsprotein blev specielt designet til at muliggøre samtidig observation af akrosomal calciumdynamik og membranfusionshændelser. Realtidsovervågning af akrosomal calciumdynamik og AE i levende AcroSensE-sæd opnås ved hjælp af en kombination af billeddannelse med høj billedhastighed og et stimulerende leveringssystem, der kan målrette mod enkelt sædceller. Denne protokol giver også flere eksempler på grundlæggende metoder til kvantificering og analyse af rådata. Fordi AcroSensE-modellen er genetisk kodet, kan dens videnskabelige betydning øges ved hjælp af let tilgængelige genetiske værktøjer, såsom krydsning med andre musegenetiske modeller eller genredigeringsbaserede metoder (CRISPR). Med denne strategi kan rollerne for yderligere signalveje i sædkapacitation og befrugtning løses. Sammenfattende giver metoden beskrevet her et praktisk og effektivt værktøj til at studere calciumdynamik i et specifikt subcellulært rum – sædakrosomet – og hvordan disse dynamikker regulerer de mellemliggende trin, der fører til membranfusion og akrosomexocytose.
Introduction
Sperm erhverver evnen til at befrugte under en proces kaldet kapacitation1. Et endepunkt i denne proces er, at sædcellerne erhverver evnen til at gennemgå AE. Over to årtiers data understøtter tilstedeværelsen af en kompleks flertrinsmodel af AE i pattedyrsæd (opsummeret i 2,3). Det er imidlertid udfordrende at studere AE i levende sædceller, og de aktuelt tilgængelige metoder til overvågning af denne proces med tilstrækkelig opløsning er besværlige og kræver flere forberedelsestrin4, er begrænset til påvisning af det sidste trin i AE (f.eks. ved hjælp af PNA5), er begrænset til målinger af ændringer i cytosolisk calcium (i modsætning til akrosomal calciumdynamik), eller er begrænset til målinger af enten cytosolisk calciumdynamik eller AE6.
For at overvinde nogle af de vigtigste begrænsninger ved AE-undersøgelser i realtid under fysiologiske forhold og for at muliggøre undersøgelse af samspillet mellem calciumdynamik og AE blev der genereret en unik musemodel. I denne musemodel udtrykkes et fusionsprotein sammensat af den genetisk kodede Ca2+-sensor (GCaMP3) og mCherry og målrettes mod akrosomet ved hjælp af en acrosinpromotor og signalpeptid2. Den målrettede dobbelte GCaMP3-mCherry-sensor muliggør samtidige realtidsmålinger af calciumkoncentrationer og status for det akrosomale indhold i levende sædceller under fysiologiske forhold ved hjælp af mikroskopi og et enkeltcellestimulerende leveringssystem (figur 1). Som en komponent i den akrosomale matrix ville membranfusion og AE resultere i tab af den fototable og pH-ufølsomme mCherry-fluorescens fra sædcellerne, da dette protein diffunderer ud af den akrosome vesikel. I denne henseende er modellens evne til at afspejle timingen og forekomsten af AE beslægtet med fordelene ved den akrosommålrettede GFP-muselinje 7,8,9.
GCaMP3-varianten, der anvendes i denne transgene muselinje, har en omtrentlig KD på 400 μM og et dynamisk område for Ca2+ på 10-4-10-3 M 10, som er egnet til denne vesikel. Vi viste, at denne kombination af funktioner i GCaMP3 kunne afsløre fusionsporedannelse mellem plasmamembranen og den ydre akrosomale membran (OAM)2. Fusionsporedetektionen er et resultat af, at porestørrelsen er for lille til at tillade AcroSensE-proteinet at sprede sig ud af akrosomet (via tab af akrosomindhold), samtidig med at der tilvejebringes en membrankanal, der muliggør tilstrømning afCa2+-ioner til det akrosomiske lumen, hvilket fører til en stigning i GCaMP3’s fluorescensintensitet.
Det lyse, monomere, ikke-calciumfølsomme fluorescerende protein mCherry understøtter visualisering af akrosomet, mens GCaMP3-signalet er svagt (f.eks. Før Ca2+ -binding, figur 2), og vigtigst af alt giver det også mulighed for identifikation af akrosomintakte sædceller, der er egnede til billeddannelse.
Følgende protokol beskriver udnyttelsen af den unikke AcroSensE-musemodel og de metoder til mikroskopi, der anvendes eksperimentelt til at studere AE og sædcalciumdynamik med høj rumlig og tidsmæssig opløsning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrives en mikroskopibaseret metode til at udnytte den nygenererede AcroSensE-musemodel til realtids, enkeltcelleovervågning og analyse af samspillet mellem akrosomal calciumdynamik og mellemliggende trin, der fører til AE. Sammen med let tilgængelige genetiske tilgange, såsom krydsning med andre musegenetiske modeller eller genredigering, giver denne model og metode et kraftfuldt system til at studere rollen som forskellige komponenter og veje, der deltager i sædsignalveje relateret til kapacitation, AE og be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud R01-HD093827 og R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
