הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואקסוציטוזה בזרע עכבר חי
Summary
מודל העכבר AcroSensE ושיטות הדמיה של תאים חיים המתוארים כאן מספקים גישה חדשה לחקר דינמיקת הסידן בתא התת-תאי של אקרוזום הזרע וכיצד הם מווסתים שלבי ביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.
Abstract
אקסוציטוזה אקרוזום (AE), שבה השלפוחית האקזוציטוטית היחידה של הזרע מתמזגת עם קרום הפלזמה, היא תהליך מורכב ותלוי סידן החיוני להפריה. עם זאת, ההבנה שלנו לגבי האופן שבו איתות סידן מווסת AE עדיין אינה שלמה. בפרט, יחסי הגומלין בין דינמיקת הסידן התוך-אקרוזומלית לבין שלבי הביניים המובילים ל-AE אינם מוגדרים היטב. במאמר זה אנו מתארים שיטה המספקת תובנות מרחביות וזמניות על דינמיקת הסידן האקרוזומלית והקשר שלה לאיחוי קרום ולאקסוציטוזה שלאחר מכן של שלפוחית האקרוזומים. השיטה משתמשת בעכבר מהונדס חדשני המבטא חיישן ממוקד אקרוזום לאקסוציטוזה (AcroSensE). החיישן משלב מחוון סידן מקודד גנטית (GCaMP) המאוחה עם mCherry. חלבון היתוך זה תוכנן במיוחד כדי לאפשר תצפית בו זמנית של דינמיקת סידן אקרוזומלית ואירועי איחוי ממברנה. ניטור בזמן אמת של דינמיקת סידן אקרוזומלית ו-AE בזרע חי של AcroSensE מושג באמצעות שילוב של הדמיה בקצב פריימים גבוה ומערכת העברת חומרים ממריצים שיכולה להתמקד בזרע יחיד. פרוטוקול זה מספק גם מספר דוגמאות לשיטות בסיסיות לכימות וניתוח הנתונים הגולמיים. מכיוון שמודל AcroSensE מקודד גנטית, ניתן להעצים את חשיבותו המדעית על ידי שימוש בכלים גנטיים זמינים, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או שיטות מבוססות עריכה גנטית (CRISPR). בעזרת אסטרטגיה זו, ניתן לפתור את תפקידיהם של מסלולי איתות נוספים בקיבול הזרע ובהפריה. לסיכום, השיטה המתוארת כאן מספקת כלי נוח ויעיל לחקר דינמיקת סידן בתא תת-תאי ספציפי – אקרוזום הזרע – וכיצד דינמיקות אלה מווסתות את שלבי הביניים המובילים לאיחוי קרום ואקסוציטוזה אקרוזומית.
Introduction
הזרע רוכש את היכולת להפרות בתהליך שנקרא קיבול1. נקודת קצה אחת של תהליך זה היא שהזרע רוכש את היכולת לעבור AE. יותר משני עשורים של נתונים תומכים בנוכחותו של מודל מורכב ורב-שלבי של AE בזרע יונקים (מסוכםב-2,3). עם זאת, חקר AE בזרע חי הוא מאתגר, והשיטות הזמינות כיום לניטור תהליך זה ברזולוציה נאותה הן מסורבלות ודורשות שלבי הכנה מרובים4, מוגבלות לזיהוי השלב הסופי של AE (למשל, באמצעות PNA5), מוגבלות למדידות של שינויים בסידן ציטוסולי (בניגוד לדינמיקה של סידן אקרוזומלי), או מוגבלים למדידות של דינמיקת סידן ציטוסולית או AE6.
כדי להתגבר על כמה מהמגבלות העיקריות של מחקרי AE בזמן אמת בתנאים פיזיולוגיים ולאפשר חקירה של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן ו- AE, נוצר מודל עכבר ייחודי. במודל עכבר זה, חלבון היתוך המורכב מחיישן Ca2+ המקודד גנטית (GCaMP3) ו-mCherry מבוטא וממוקד לאקרוזום באמצעות מקדם אקרוסין ופפטיד איתות2. חיישן GCaMP3-mCherry כפול ממוקד מאפשר מדידות סימולטניות בזמן אמת של ריכוזי הסידן ומצב התוכן האקרוזומלי בזרע חי בתנאים פיזיולוגיים באמצעות מיקרוסקופיה ומערכת העברת ממריצים חד-תאית (איור 1). כמרכיב של המטריצה האקרוזומלית, איחוי הממברנה, ו- AE יגרום לאובדן פלואורסצנטיות mCherry שאינה רגישה לפוטו ול- pH מהזרע, מכיוון שחלבון זה מתפזר החוצה משלפוחית האקרוזומים. בהקשר זה, היכולת של המודל לשקף את העיתוי וההתרחשות של AE דומה ליתרונות של קו העכבר GFP ממוקד אקרוזום 7,8,9.
גרסת GCaMP3 המשמשת בקו עכברים מהונדס זה היא בעלת KD משוער של 400 מיקרומטר וטווח דינמי עבור Ca2+ של 10-4-10-3 M10, המתאים לשלפוחית זו. הראינו כי שילוב תכונות זה של GCaMP3 יכול לחשוף היווצרות נקבוביות היתוך בין קרום הפלזמה לבין הממברנה האקרוזומלית החיצונית (OAM)2. זיהוי נקבוביות האיחוי הוא תוצאה של גודל הנקבוביות קטן מכדי לאפשר לחלבון AcroSensE להתפזר החוצה מהאקרוזום (באמצעות אובדן תוכן אקרוזומים) תוך מתן “תערוץ” ממברנה המאפשר זרימה של יוני Ca2+ לתוך לומן האקרוזומים, מה שמוביל לעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות של GCaMP3.
החלבון הפלואורסצנטי mCherry הבהיר, המונומרי והלא רגיש לסידן תומך בהדמיה של האקרום בזמן שהאות GCaMP3 חלש (למשל, לפני קשירת Ca2+ , איור 2), וחשוב מכך, הוא גם מאפשר זיהוי של תאי זרע שלמים אקרוזומים, המתאימים להדמיה.
הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש במודל העכבר הייחודי AcroSensE ואת שיטות המיקרוסקופ המשמשות באופן ניסיוני לחקר AE ודינמיקת סידן זרע ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, מתוארת שיטה מבוססת מיקרוסקופיה המשתמשת במודל העכבר החדש שנוצר AcroSensE לניטור וניתוח בזמן אמת, תא בודד של יחסי הגומלין בין דינמיקת סידן אקרוזומלית ושלבי ביניים המובילים ל- AE. יחד עם גישות גנטיות זמינות, כגון הכלאה עם מודלים גנטיים אחרים של עכברים או עריכת גנים, מודל ושיטה אלה מספקים מערכת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01-HD093827 ו- R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
