실시간 이미징 of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm
Summary
여기에 설명된 AcroSensE 마우스 모델 및 살아있는 세포 이미징 방법은 정자 아크로솜의 세포 내 구획에서 칼슘 역학을 연구하고 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공합니다.
Abstract
정자의 단일 외세포 소포가 원형질막과 융합하는 Acrosome exocytosis(AE)는 수정에 필수적인 복잡한 칼슘 의존적 과정입니다. 그러나 칼슘 신호전달이 AE를 조절하는 방법에 대한 우리의 이해는 아직 불완전합니다. 특히, 아크로솜 내 칼슘 역학과 AE로 이어지는 중간 단계 사이의 상호 작용은 잘 정의되어 있지 않습니다. 여기에서는 아크로솜 칼슘 역학에 대한 공간적, 시간적 통찰력과 막 융합 및 아크로솜 소포의 후속 엑소사이토시스와의 관계를 설명합니다. 이 방법은 엑소사이토시스(Exocytosis)를 위한 아크로솜 표적 센서(AcroSensE)를 발현하는 새로운 형질전환 마우스를 활용합니다. 이 센서는 mCherry와 융합된 유전자 인코딩 칼슘 표지자(GCaMP)를 결합합니다. 이 융합 단백질은 아크로솜 칼슘 역학과 막 융합 현상을 동시에 관찰할 수 있도록 특별히 설계되었습니다. 살아있는 AcroSensE 정자에서 아크로솜 칼슘 역학 및 AE의 실시간 모니터링은 높은 프레임 속도 이미징과 단일 정자를 표적으로 할 수 있는 자극제 전달 시스템의 조합을 사용하여 달성됩니다. 이 프로토콜은 또한 원시 데이터를 정량화하고 분석하는 기본 방법의 몇 가지 예를 제공합니다. AcroSensE 모델은 유전적으로 암호화되어 있기 때문에 다른 마우스 유전자 모델과의 교배 또는 유전자 편집(CRISPR) 기반 방법과 같이 쉽게 사용할 수 있는 유전 도구를 사용하여 과학적 중요성을 높일 수 있습니다. 이 전략을 통해 정자 용량 및 수정에서 추가 신호 전달 경로의 역할을 해결할 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명된 방법은 특정 세포 내 구획(정자 아크로솜)의 칼슘 역학을 연구하고 이러한 역학이 막 융합 및 아크로솜 엑소사이토시스로 이어지는 중간 단계를 조절하는 방법을 연구하는 편리하고 효과적인 도구를 제공합니다.
Introduction
정자는 용량화(capacitation)1라고 불리는 과정을 통해 수정될 수 있는 능력을 획득한다. 이 과정의 한 가지 종점은 정자가 AE를 받을 수 있는 능력을 획득한다는 것입니다. 20년 이상의 데이터는 포유류 정자에서 AE의 복잡한 다단계 모델의 존재를 뒷받침합니다(2,3으로 요약됨). 그러나, 살아있는 정자에서 AE를 연구하는 것은 어려운 일이며, 적절한 분해능으로 이 과정을 모니터링하기 위해 현재 이용 가능한 방법은 번거롭고 여러준비 단계를 필요로 하며4, AE의 마지막 단계의 검출(예: PNA5 사용)로 제한되며, 세포질 칼슘의 변화 측정으로 제한되며(아크로솜 칼슘 역학과 대조적으로), 또는 세포질 칼슘 역학 또는 AE6의 측정으로 제한됩니다.
생리학적 조건에서 실시간 AE 연구의 주요 한계 중 일부를 극복하고 칼슘 역학과 AE 간의 상호 작용을 조사할 수 있도록 고유한 마우스 모델이 생성되었습니다. 이 마우스 모델에서는 유전적으로 인코딩된 Ca2+-센서(GCaMP3)와 mCherry로 구성된 융합 단백질이 발현되고 아크로신 프로모터 및 신호 펩타이드2를 사용하여 아크로솜을 표적화합니다. 표적 이중 GCaMP3-mCherry 센서는 현미경 및 단세포 자극제 전달 시스템을 사용하여 생리학적 조건에서 살아있는 정자의 칼슘 농도와 아크로솜 함량 상태를 동시에 실시간으로 측정할 수 있습니다(그림 1). 아크로솜 매트릭스의 구성 요소인 막 융합 및 AE는 이 단백질이 아크로솜 소포에서 확산됨에 따라 정자에서 광안정성 및 pH에 민감하지 않은 mCherry 형광의 손실을 초래합니다. 이와 관련하여, AE의 타이밍 및 발생을 반영하는 모델의 능력은 아크로솜-표적 GFP 마우스 라인(7,8,9)의 이점과 유사하다.
이 형질전환 마우스 라인에 사용된 GCaMP3 변이체는 약 400μM의 KD와 10-4-10-3M10의 Ca2+에 대한 동적 범위를 가지며 이 소포에 적합합니다. 우리는 GCaMP3의 이러한 특징의 조합이 원형질막과 외부 아크로솜막(OAM) 사이의 융합 공극 형성을 나타낼 수 있음을 보여주었습니다2. 융합 기공 검출은 공극 크기가 너무 작아서 AcroSensE 단백질이 아크로솜 내강 내강으로 Ca2+ 이온을 유입할 수 있는 막 “채널”을 제공하여 GCaMP3의 형광 강도를 증가시키는 동시에 AcroSensE 단백질이 아크로솜 밖으로 분산될 수 없기 때문입니다.
밝고 단량체이며 칼슘에 민감하지 않은 형광 단백질 mCherry는 GCaMP3 신호가 희미할 때(예: Ca2+ 결합 전, 그림 2) 아크로솜의 시각화를 지원하며, 중요한 것은 이미징에 적합한 아크로솜 온전한 정자 세포를 식별할 수 있다는 것입니다.
다음 프로토콜은 고유한 AcroSensE 마우스 모델의 활용과 높은 공간 및 시간 분해능으로 AE 및 정자 칼슘 역학을 연구하기 위해 실험적으로 사용되는 현미경 검사 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 아크로솜 칼슘 역학과 AE로 이어지는 중간 단계 간의 상호 작용에 대한 실시간 단일 세포 모니터링 및 분석을 위해 새로 생성된 AcroSensE 마우스 모델을 활용하기 위한 현미경 기반 방법을 설명합니다. 다른 마우스 유전자 모델과의 교배 또는 유전자 편집과 같이 쉽게 사용할 수 있는 유전적 접근법과 함께 이 모델 및 방법은 용량, AE 및 수정과 관련된 정자 신호 경로에 참여하는 다양한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 R01-HD093827 및 R03-HD090304(A.J.T)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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