Imagem em Tempo Real da Dinâmica do Cálcio Acrossomal e Exocitose em Espermatozoides Vivos de Camundongos

Resumo

O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.

Resumo

A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico - o acrossoma espermático - e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.

Introdução

Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação¹. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em ^2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação⁴, são limitados à detecção da ....

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell (#2002-0095). Camundongos AcroSensE² com 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Pedidos de informação sobre a disponibilidade dos ratos AcroSensE podem ser submetidos ao autor correspondente.

1. Coleta e lavagem de espermatozoides

1. Coletar espermatozoides epididimais caudais (mais detalhes sobre este procedimento são fornecidos em¹¹) de camundongos AcroSensE. Permitir 15 mi....

Resultados

A Figura 2 fornece uma ilustração simplificada mostrando a sequência de mudanças de fluorescência esperadas após a estimulação bem-sucedida dos espermatozoides. O painel superior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade da fluorescência do GCaMP3, onde o sinal é inicialmente fraco (as concentrações basais de cálcio acrossomal são menores que o GCaMP3 KD), e na entrada de íons cálcio através dos poros de fusão, a fluorescência aumenta em brilho. Fi.......

Discussão

Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias que participam das v.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Objetiva de óleo 100x	Olympus Japan
	Prato de	C0926
35 mm, espessura de 1,5	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
Tubo de fundo redondo de 5 mL	Falcon	352054
Vidro borossilicato capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Microscópio confocal	Olympus Japão	Olympus FluoView
Glicose	Sigma	G7528
	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Ácido Láctico	Sigma	G5889
Sistemas de Incubação de Microscópio de Células Vivas	TOKAI HIT Shizuoka, Modelo	Japonês STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipeta Extrator	Sutter Instrument Co. CA USA	Modelo P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Pipeta de transferência de plástico	Marca Fisher	13-711-6M
Poli-D-lisina	Sigma	P7280
Ácido pirúvico	Sigma	107360
Sistema de entrega de célula única	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III

UPlanApo,2-hidroxipropil-b-ciclodextrina lamínula Sigma Ponta graduada