本方案介绍了一种基于α-突触核蛋白建立便秘模型的实验方法 果蝇 帕金森病模型
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摘要
摘要
帕金森病（PD）中的非运动症状十分常见，难以治疗，且显著影响患者生活质量。其中一种常见的非运动症状是便秘，可能在帕金森病确诊前数年甚至数十年就已出现。目前在帕金森病的动物模型中，对便秘的研究尚不充分，且缺乏特异性疗法。本实验采用一种表达人类α-突触核蛋白（alpha-synuclein）的帕金森病Drosophila模型，该蛋白在全神经元驱动子的调控下表达。表达α-突触核蛋白的果蝇会发展出帕金森病的典型特征：多巴胺能神经元的丧失、运动功能障碍以及α-突触核蛋白包涵体。
本方案概述了一种研究这些果蝇便秘现象的方法。将果蝇置于添加了蓝色染料的培养基中过夜，次日转移至标准培养基。随后每小时将果蝇转移至装有标准果蝇培养基的新离心管中，持续8小时。每次转移前，计算离心管壁上蓝色粪斑占总粪斑数的百分比。缺乏α-突触核蛋白的对照组果蝇排出蓝色染料的时间显著早于表达α-突触核蛋白的果蝇。此外，可通过简单的摄影方法监测蓝色食物在肠道中的通过情况。该检测方法操作简便，可用于正向遗传学筛选或化学筛选，以鉴定影响黑腹果蝇（Drosophila）便秘的调控因子。
引言
帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种进行性神经退行性疾病，临床特征为存在运动症状，如运动迟缓、僵直和震颤，导致显著的病态性表现1。从病理学角度看，PD 的特征是黑质中多巴胺能神经元的丧失以及α-突触核蛋白的错误折叠，从而形成路易小体和路易神经突。PD 的发病机制尚不明确，可能由遗传因素与环境因素之间的复杂相互作用引起2,3。目前尚无疾病修饰疗法，部分原因可能是诊断时病理已处于较晚期。研究表明，在运动症状出现时，黑质中的多巴胺能神经元损失已超过60%，凸显了探索可用于早期疾病检测的潜在生物标志物的必要性4。其中一个临床生物标志物是便秘，这在 PD 患者中十分常见5,6，且可能在运动症状出现前数年甚至数十年就已发生。
尽管帕金森病（PD）的临床定义基于运动症状，但便秘是多种非运动症状之一，这些症状在对症治疗上更具挑战性，并显著影响患者的生活质量7。肠道-脑轴（gut-brain axis）的改变被认为参与了帕金森病的发病机制，该轴代表大脑与肠神经系统之间的双向通信。已在帕金森病患者的胃肠道组织样本中发现α-突触核蛋白（alpha-synuclein）聚集体8，动物模型表明，肠神经系统中的α-突触核蛋白聚集体以类似朊病毒的方式向中枢神经系统传播9。此外，帕金森病患者存在肠道微生物组的异常10，并可能出现过度的肠道炎症11。帕金森病相关的便秘研究尚不充分，目前关于果蝇12,13或啮齿类动物14,15中帕金森病相关便秘的报道模型极少。
本实验采用一种帕金森病（PD）的 Drosophila 模型，该模型果蝇在全神经元驱动子 n-synaptobrevin 的调控下表达人源 alpha-synuclein 基因。这些果蝇表现出 PD 的所有典型特征，包括 alpha-synuclein 蛋白聚集、运动功能障碍以及与年龄相关的神经退行性病变，最终导致多巴胺能神经元的丢失16,17。既往研究已引入果蝇排泄物输出量的检测方法，用于评估肠道功能障碍，通过量化果蝇粪便物质并比较不同遗传品系间的排泄物量，揭示消化系统的功能差异18,19,20。本文中，我们展示了利用表达人源 alpha-synuclein 的果蝇进行便秘检测的方法。这一简单而有价值的工具可用于研究帕金森病重要的非运动症状。
方案
本实验所用果蝇：对照组：nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+；α-突触核蛋白果蝇：nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+；羽化后1天和10天；雄性和雌性（交配与未交配）果蝇（参见材料表）。
1. 准备染色果蝇食物
- 将蓝色软凝胶食用色素（参见材料表）与蒸馏水按1:1的体积比混合。
注意：请使用仅含不可吸收染料的市售食用色素，因为某些蓝色染料已被证明具有神经保护作用21。 - 将含有标准玉米粉-琼脂培养基的果蝇食物小瓶（参见材料表）放入微波炉中，以10–15秒为间隔加热，直至培养基融化成液体或浆状。注意避免培养基沸腾溢出。
- 将染料混合液加入每瓶培养基中，使各瓶颜色均匀一致。持续搅拌直至培养基呈现均一的蓝色（图1）。加入适量蓝色染料混合液，使培养基颜色饱和，且各瓶之间无颜色差异。
注意：此步骤应在微波加热后尽快完成，因为培养基会迅速凝固。若培养基已凝固，可再次进行微波加热。 - 将染色后的培养基小瓶静置于空气中干燥，直至完全凝固。干燥过程中在瓶口覆盖一层薄纸巾，以防止果蝇意外落入瓶内。
- 待培养基冷却并凝固后，将用于实验的果蝇转移至蓝色培养基中。
注意：对于窄口小瓶（25 mm），建议每瓶加入9–14只果蝇；对于宽口小瓶（28.5 mm），建议每瓶加入10–20只果蝇。果蝇不分性别或交配状态，包含雄性和雌性果蝇的混合群体，其中雌性包括已交配和未交配个体。 - 将装有果蝇的小瓶置于25 °C培养箱中过夜孵育。
2. 观察果蝇
注意：此步骤为可选步骤（图 2）。
- 次日早晨（时间0），用二氧化碳麻醉代表性果蝇60秒。将果蝇放置成腹面朝上。
- 使用相机（见材料表），每小时拍摄一次果蝇图像，以观察消化系统中残留的蓝色食物量。
注意：这些果蝇不应用于实验的定量部分（步骤3），因为麻醉可能影响结果。 - 每小时麻醉并拍摄一组新的果蝇。
3. 进行便秘实验检测
- 将剩余的（未麻醉的）果蝇转移至含有标准 Drosophila 食物的小瓶中。为每个小瓶编号。
- 将果蝇置于25 °C培养箱中静置60分钟。
- 60分钟后，将果蝇转移至含有标准 Drosophila 食物的新小瓶中。从第一组小瓶开始记录数据。
- 沿小瓶长度方向画一条虚线，标记计数的起始位置。
- 人工计数每个小瓶壁上小而圆形斑点的数量。不要计数位于食物或小瓶塞上的斑点。
- 首先计数每个小瓶壁上蓝色斑点的数量。
- 计数每个小瓶壁上不透明、无色斑点的数量。
注意：每个斑点均为果蝇排泄物，是尿液与粪便的混合物22。有时果蝇会爬过排泄物并留下痕迹，此时仅计数原始斑点，不计数痕迹中的各个独立印记。 - 记录每个小瓶中蓝色斑点数与总斑点数的比值。
注意：总斑点数为同一小瓶壁上蓝色斑点数与无色斑点数之和。该比值将用于计算每小时蓝色粪便物质的百分比。 - 重复步骤3.2–3.8共七次，每小时收集一次数据，总计持续8小时。
4. 数据分析
- 绘制每种条件下每小时蓝色粪便物质的百分比图。
- 比较不同条件之间的数据。
注意：可通过三种方式确定统计学显著性：比较不同条件间各个时间点的数据、测量随时间变化曲线的斜率，或比较曲线下面积。
结果
由于黑腹果蝇（Drosophila）的腹部是透明的，因此可以在活体麻醉的果蝇体内观察到肠道中的蓝色食物。通过在不同时间点拍摄果蝇图像，可定性评估肠道转运的差异。在对照组果蝇中，蓝色食物会迅速排出；而在α-突触核蛋白果蝇中，蓝色食物可在肠道内滞留长达8小时（图2）。
α-突触核蛋白果蝇表现出与年龄相关的神经退行性变，羽化后10天即可观察到显著的表型10。在此时间点，通过比较不同条件下各时间点的个体值、分析随时间变化的曲线斜率，或比较曲线下面积，均可发现其肠道转运时间与对照组果蝇存在差异（图3）。而在更早的时间点——羽化后第1天，对照组与α-突触核蛋白果蝇之间的肠道转运时间无显著差异，此时运动功能障碍和神经退行性变也尚未出现（图4）。
图 1：蓝色食物小瓶及粪斑。 （A）所有小瓶均含有蓝色食物。此时，果蝇刚被放入蓝色食物中，尚无可见的蓝色排泄物。（B）将 w1118 果蝇转移至新鲜食物中 1 小时后移除的小瓶。左侧插图为（C）的放大图，右侧插图为（D）的放大图。（C）因存在果蝇食物而被排除在分析范围之外的区域。（D）粪斑的放大视图，显示蓝色斑点（黑色箭头）和非蓝色斑点（黄色箭头）。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：染色食物在肠道中随时间推移的转运可视化。 对照组果蝇及在神经元中表达人源α-突触核蛋白的果蝇被置于蓝色染色食物上过夜，次日转移至标准培养基。随后每小时将果蝇依次转移至新的标准果蝇食物中。图中显示了转移后0、2、4、6和8小时的代表性图像。在0小时时间点，对照组和α-突触核蛋白果蝇的肠道中均可见相似的蓝色食物斑块。在后续时间点，对照组果蝇肠道中的蓝色食物少于α-突触核蛋白果蝇，且在8小时时间点，对照组果蝇体内已无任何蓝色食物残留。各果蝇品系的基因型如下：对照组（nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+）；α-突触核蛋白果蝇（nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+）。成像实验使用雌性果蝇，因其体型较大，更易于观察腹部结构。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：羽化后第10天果蝇的便秘检测。 对照组果蝇及在神经元中表达人源α-突触核蛋白的果蝇，先在含蓝色染料的食物上放置过夜，次日转移至标准果蝇培养基。果蝇每小时依次转移至新的标准培养基中。(A) 每小时排出的蓝色粪便物质百分比。误差线表示标准差。每种基因型 N = 6 管，每管含 9–14 只果蝇。所有统计分析均在 Graphpad Prism 软件中进行（见材料表）。各时间点的统计学显著性通过双因素方差分析（two-way ANOVA）计算；直线斜率及其差异通过线性回归分析确定。(B) 每种基因型曲线下面积（AUC）的计算结果。误差线表示标准差。各果蝇品系的基因型如下：对照组 (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+)；α-突触核蛋白果蝇 (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+)。实验中包含数量大致相等的雄性和雌性果蝇。请点击此处查看该图的高清版本。
图4：羽化后第1天果蝇的便秘检测。 对照组果蝇及在神经元中表达人源α-突触核蛋白的果蝇在含蓝色染料的食物上过夜，次日转移至标准培养基。果蝇每小时依次转移至新的标准果蝇食物中。(A) 每小时排出蓝色粪便的百分比。误差线表示标准差。每种基因型至少使用5个样品瓶；每个样品瓶包含9–14只果蝇。所有统计分析均在Graphpad Prism软件中进行。各时间点的统计学显著性通过双因素方差分析（two-way ANOVA）计算。直线斜率及斜率差异通过线性回归分析计算。(B) 计算每种基因型曲线下面积。误差线表示标准差。各果蝇品系的基因型如下：对照组 (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+)；α-突触核蛋白果蝇 (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha-synuclein/+)。实验中包含数量大致相等的雄性和雌性果蝇。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本实验方案中有多个步骤有助于成功完成检测。首先，必须确保每个离心管在每一轮实验中的时间间隔保持一致。使用数字标记离心管可避免冗长的基因型描述，节省时间。此外，整个实验过程中粪便计数方法必须保持一致22。蓝色粪便在培养基和离心管塞上可见，而无色粪便则不可见。因此，不要将培养基或离心管塞上的蓝色斑点计为粪便。
在行为学实验中，由于果蝇行为的波动或影响实验的未知变量，实验结果始终可能存在不一致的情况。我们建议在所有实验中使用相同的 Drosophila 培养基、相同的食用染料以及相同品牌的试剂管。有趣的是，在多次试验中观察到，果蝇在下午早些时候排便频率较低，这可能与果蝇的昼夜节律有关23。然而，这种行为在对照组果蝇和表达α-突触核蛋白的果蝇中均一致存在，因此不应引起担忧。
如果果蝇在实验开始时未排出蓝色粪便，可能是因为所用染料的着色度不足。此时，可相应增加染料与蒸馏水的比例。此外，当果蝇消化道内仅残留少量蓝色食物时，可能难以判断粪便为浅蓝色还是无色。遇到这种情况，可在试管后方放置一张白纸，以帮助辨别粪便斑点的颜色。即使粪便颜色极浅，也应记录为蓝色粪便，而非无色粪便。
该实验方法的一个局限性在于需要手动计数粪便斑点。为了提高高通量筛选的潜力，未来可对该方案进行改进，以实现对多孔板中单只果蝇产生的蓝色粪便斑点进行自动化定量分析。另一个局限性是，尽管α-突触核蛋白模型有望被开发为帕金森病（PD）的前驱期模型，但目前尚未确定一个最佳的时间点，即出现便秘但尚无神经退行性变的时间点。
总之，该方法提供了一种简单直接的方式，利用帕金森病（PD）的黑腹果蝇（Drosophila）模型来模拟便秘这一尚未被充分研究的非运动性PD症状。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢布莱根妇女医院和哈佛医学院的Mel Feany博士惠赠对照组及表达α-突触核蛋白的Drosophila果蝇品系。我们感谢以下机构对Olsen博士提供的资助支持：NINDS K08项目、美国帕金森病协会George C. Cotzias奖学金、美国国防部帕金森病早期研究者奖。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1400 g 蔗糖 | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g 葡萄糖 | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g 酵母 | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g 琼脂 | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL 糖蜜 | 祖母的糖浆 | 7971942 | |
| 68 L 水 | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept 混合液（1200 g tegosept 溶于 6 L 乙醇中） | |||
| 6864 g 玉米粉 | 珍珠研磨 | 125045 | |
| 800 mL 酸混合液（83 mL 磷酸溶于 1 L 水 + 836 mL 丙酸溶于 1 L 水） | |||
| cellSens Standard 软件 | Olympus | N/A | |
| 乙醇 | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| 宽口塑料小瓶用果蝇 | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff 宽型果蝇培养管，聚苯乙烯 | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | 版本 9.5.1 |
| Olympus DP23 相机 | Olympus | N/A | |
| 奥林巴斯SZX12体视显微镜 | Olympus | N/A | |
| 磷酸 | Fisher Scientific | S25470A | |
| 丙酸 | Fisher Scientific | A258 - 500 | |
| 软凝胶膏状食用色素，宝蓝色 | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | 顶点 | 20-258 | |
| <显著>果蝇品系 | |||
| nSyb-QF2，nSyb-Gal4 | 所有品系均由 Mel Feany 博士提供 | N/A | 品系可直接向 Feany 博士索取 |
| nSyb-QF2，nSyb-Gal4，QUAS-α-synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
参考文献
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