Denne protokollen presenterer en analyse for modellering av forstoppelse i en alfa-synucleinbasert Drosophila-modell av Parkinsons sykdom.
Ikke-motoriske symptomer ved Parkinsons sykdom (PD) er vanlige, vanskelige å behandle og svekker livskvaliteten betydelig. Et utbredt ikke-motorisk symptom er forstoppelse, som kan gå foran diagnosen PD i år eller til og med tiår. Forstoppelse har vært underutforsket i dyremodeller av PD og mangler spesifikke terapier. Denne analysen benytter en Drosophila-modell av PD der humant alfa-synuclein uttrykkes under en pan-neuronal driver. Fluer som uttrykker alfa-synuclein utvikler kjennetegnene til PD: tap av dopaminerge nevroner, motorisk funksjonsnedsettelse og alfa-synucleininneslutninger.
Denne protokollen skisserer en metode for å studere forstoppelse i disse fluene. Fluer settes på fluefôr med blått fargetilsetningsstoff over natten og overføres deretter til vanlig fôr dagen etter. De blir deretter flyttet til nye hetteglass med vanlig fluemat hver time i 8 timer. Før hver overføring beregnes prosentandelen blåfargede fekale flekker sammenlignet med de totale fekale flekkene på hetteglassveggen. Kontrollfluer som mangler alfa-synuclein utviser alle de blå fargestoffene timer før fluer som uttrykker alfa-synuclein. I tillegg kan passasjen av blåfarget mat fra tarmen overvåkes med enkel fotografering. Enkelheten i denne analysen gjør det mulig å bruke den i fremadrettede genetiske eller kjemiske skjermer for å identifisere modifikatorer av forstoppelse i Drosophila.
Parkinsons sykdom (PD) er en progressiv nevrodegenerativ lidelse karakterisert klinisk ved tilstedeværelse av motoriske symptomer som bradykinesi, stivhet og tremor, noe som resulterer i betydelig sykelighet1. Patologisk er PD definert ved tap av dopaminerge nevroner i substantia nigra og feilfolding av alfa-synuclein, noe som fører til dannelse av Lewy-legemer og Lewy-nevritter. Patogenesen av PD er fortsatt dårlig forstått, sannsynligvis som følge av et komplekst samspill mellom genetiske og miljømessige faktorer 2,3. For tiden er sykdomsmodifiserende terapier utilgjengelige, muligens delvis på grunn av det avanserte stadiet av patologi som er tilstede på diagnosetidspunktet. Studier har vist at mer enn 60% av dopaminerge nevroner i substantia nigra allerede har gått tapt ved utbruddet av motoriske symptomer, understreker behovet for å utforske potensielle biomarkører for tidlig sykdomsdeteksjon4. En slik klinisk biomarkør er forstoppelse, som er vanlig hos PD-pasienter 5,6 og kan gå foran motorisk symptomdebut med år eller til og med tiår.
Til tross for PDs kliniske definisjon basert på motoriske symptomer, er obstipasjon et av flere ikke-motoriske symptomer som er mer utfordrende å behandle symptomatisk og gir betydelig svekkelse av pasientenes livskvalitet7. Endringer i tarm-hjerneaksen, som representerer toveis kommunikasjon mellom hjernen og det enteriske nervesystemet, har vært involvert i PD-patogenesen. Alfa-synuclein-aggregater er funnet i vevsprøver fra mage-tarmkanalen hos PD-pasienter8, og dyremodeller tyder på at alfa-synucleinaggregater i det enteriske nervesystemet sprer seg på en prionlignende måte til sentralnervesystemet9. I tillegg viser PD-pasienter abnormiteter i tarmmikrobiomet10 og kan oppleve overdreven tarmbetennelse11. Forstoppelse i PD har blitt understudert, med få rapporterte modeller av Parkinsons-assosiert forstoppelse hos fluer12,13 eller gnagere14,15.
Denne analysen benytter en Drosophila-modell av PD der fluer uttrykker det humane alfa-synuclein-genet under kontroll av en pan-neuronal driver, n-synaptobrevin. Disse fluene viser alle kjennetegnene til PD, inkludert alfa-synucleinaggregering, motorisk dysfunksjon og aldersrelatert nevrodegenerasjon, noe som resulterer i tap av dopaminerge nevroner16,17. Tidligere studier har introdusert måling av fekal produksjon i fluer for å vurdere tarmdysfunksjon, kvantifisering av fluefekal materie og sammenligning av ekskretamengder over ulike genetiske linjer for å avsløre funksjonelle forskjeller i fordøyelsessystemet 18,19,20. Her demonstrerer vi forstoppelsesanalysen ved hjelp av fluer som uttrykker humant alfa-synuclein. Dette enkle, men verdifulle verktøyet gjør det mulig å studere et viktig ikke-motorisk symptom på PD.
Det er flere trinn i denne protokollen som vil hjelpe til med vellykket gjennomføring av analysen. For det første er det viktig å sikre at tidsintervallene mellom hver runde for hvert hetteglass er konsistente gjennom hele eksperimentet. Merking av hetteglassene med tall vil bidra til å unngå behovet for lange genotypebeskrivelser, noe som sparer tid. I tillegg er det avgjørende at metoden for å telle avføring22 forblir konsistent gjennom hele forsøket. Mens blått avføring er synlig på maten og hetteglasspluggen, er fargeløs avføring ikke. Tell derfor ikke de blå prikkene på maten eller hetteglasspluggen.
Med atferdsanalyser er det alltid en mulighet for inkonsekvenser i resultatene på grunn av svingninger i flueoppførsel eller ukjente variabler som påvirker analysen. Vi anbefaler å bruke samme Drosophila-medium , samme matfargestoff og samme merke av hetteglass for alle eksperimenter. Interessant nok ble det i flere forsøk observert at fluer har en tendens til å gjøre sitt fornødne sjeldnere tidlig på ettermiddagen, muligens på grunn av fluenes døgnrytme23. Imidlertid er denne oppførselen konsistent i både kontrollfluer og fluer som uttrykker alfa-synuclein, så det bør ikke gi bekymringer.
Hvis fluene ikke skiller ut blått avføring i begynnelsen av analysen, er det mulig at fargestoffet som brukes ikke er pigmentert nok. I dette tilfellet kan man øke forholdet mellom fargestoff og destillert vann tilsvarende. Det er også mulig at når det bare er en liten mengde blå mat igjen i fluens fordøyelseskanal, kan det være vanskelig å avgjøre om avføringen er lyseblå eller fargeløs. Når dette skjer, vil det å plassere et hvitt ark bak hetteglasset bidra til å bestemme fargen på fekalprikken. Selv om avføringen er veldig lyseblå, er det best å registrere det som blått avføring i stedet for fargeløst avføring.
En begrensning av denne analysen er at den krever manuell telling av fekale flekker. For å forbedre potensialet for screening med høy gjennomstrømning, kan denne protokollen endres i fremtiden for å muliggjøre automatisert kvantifisering av blå fekale flekker produsert av individuelle fluer i flerbrønnsplater. En annen begrensning er at selv om alfa-synuclein-modellen har potensial til å bli utviklet til en prodromalmodell av PD, er det ennå ikke identifisert et optimalt tidspunkt hvor forstoppelse er tilstede uten nevrodegenerasjon.
Oppsummert gir denne metoden en enkel, grei tilnærming til modellering av forstoppelse, et understudert ikke-motorisk PD-symptom, i en Drosophila-modell av PD.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Dr. Mel Feany ved Brigham and Women’s Hospital og Harvard Medical School for den vennlige gaven av kontrollen og alfa-synuclein som uttrykker Drosophila-linjer . Vi anerkjenner følgende kilder til tilskuddsstøtte til Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson’s Disease Early Investigator Award.
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |