Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Indfangning af cytoskeletbaseret agitation af museoocytkernen på tværs af rumlige skalaer

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1
1Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS, 3Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology

Summary

Denne protokol giver en eksperimentel ramme til at dokumentere cytoskelettets fysiske indvirkning på nuklear form og de indre membranløse organeller i museoocytsystemet. Rammen kan tilpasses til brug i andre celletyper og sammenhænge.

Abstract

En stor udfordring i forståelsen af årsagerne til kvindelig infertilitet er at belyse mekanismer, der styrer udviklingen af kvindelige kønsceller, navngivne oocytter. Deres udvikling er præget af cellevækst og efterfølgende opdelinger, to kritiske faser, der forbereder oocyten til fusion med sædceller for at initiere embryogenese. Under vækst omorganiserer oocytter deres cytoplasma for at placere kernen i cellecentret, en begivenhed, der forudsiger vellykket oocytudvikling hos mus og mennesker og dermed deres embryogene potentiale. I museoocytter viste denne cytoplasmatiske reorganisering sig at være drevet af cytoskelettet, hvis aktivitet genererer mekaniske kræfter, der agiterer, omplacerer og trænger ind i kernen. Følgelig indstiller denne cytoplasmatiske til nukleoplasmatiske krafttransmission dynamikken i nukleare RNA-behandlingsorganeller kendt som biomolekylære kondensater. Denne protokol giver en eksperimentel ramme til med høj tidsmæssig opløsning at dokumentere cytoskelettets indvirkning på kernen på tværs af rumlige skalaer i museoocytter. Det beskriver billeddannelses- og billedanalysetrin og værktøjer, der er nødvendige for at evaluere i) cytoskeletal aktivitet i oocytcytoplasmaet, ii) cytoskeletbaseret agitation af oocytkernen og iii) dens virkninger på biomolekylær kondensatdynamik i oocytnukleoplasmaet. Ud over oocytbiologi kan de metoder, der er uddybet her, tilpasses til brug i somatiske celler til tilsvarende adressering af cytoskeletbaseret tuning af nuklear dynamik på tværs af skalaer.

Introduction

Nuklear positionering er afgørende for flere cellulære og udviklingsmæssige funktioner 1,2,3,4,5. Pattedyrs kvindelige kønsceller ved navn oocytter ombygger deres cytoplasma for at placere kernen i cellecentret på trods af at de gennemgår en asymmetrisk opdeling i størrelse, som er afhængig af efterfølgende kromosom off-centrering6 (figur 1). Denne centrering af kernen forudsiger vellykket oocytudvikling hos mus og mennesker 7,8 og dermed deres embryogene potentiale (figur 1).

Cytoplasmatisk remodellering i museoocytter drives primært af actomyosincytoskelettet9 (figur 2). Dens aktivitet genererer mekaniske kræfter, der omrører, omplacerer og trænger ind i kernen10 (figur 2). Derfor indstiller denne cytoplasmatiske til nukleoplasmatiske krafttransmission dynamikken i nukleare messenger RNA-behandlingsorganeller ved navn nukleare pletter11, en af flere membranløse organeller i kernen kendt som biomolekylære kondensater 12,13,14,15,16 (figur 2).

Live billeddannelse har været afgørende for at dechifrere de funktionelle konsekvenser af nuklear agitation. Film af nuklear migration over timer samt film med høj tidsmæssig opløsning af actinnettet og bulkcytoplasmaet bidrog stort set til udarbejdelsen af en teoretisk model for nuklear positionering, der forbinder forskellige tidsskalaer9. Også film med høj tidsmæssig opløsning af cytoplasmaet, nuklear kontur og nukleare komponenter såsom kromatin og nukleare kondensater fremhævede rollen som cytoskeletbaseret agitation af kernen på RNA-behandling og genekspression i museoocytter, der bygger bro mellem forskellige rumlige tidsmæssige skalaer i cellen10,11. Alt i alt gav en sådan skalakrydsningstilgang baseret på levende billeddannelse den første begrundelse, der forbinder cytoskeletal agitation af kernen med oocytternes udviklingssucces.

Protokollen tilvejebringer billeddannelses- og billedanalysepipelinen, der anvendes til at studere transmissionen af cytoplasmatiske kræfter (genereret primært af F-actin og delvist af mikrotubuli) til kernen og dens interne komponenter i museoocytter. Resultatet af disse eksperimenter er at fange kontinuummet af kræfter på tværs af rumlige skalaer, fra cytoskelettet i cytoplasmaet til det nukleare indre via film med høj tidsmæssig opløsning som vist i to nylige undersøgelser10,11, der etablerede forbindelsen mellem cytoplasmatiske aktive bevægelser, udsving i den nukleare kontur samt bevægelse og overfladeudsving af en enkelt type nukleare biomolekylære kondensater: nukleare pletter. Den samme fremgangsmåde kan anvendes på andre modelsystemer, hvor cytoplasmatiske kræfter forventes at ændre sig, f.eks. i forbindelse med maligne kræftceller17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs retningslinjer og blev godkendt af det franske landbrugsministerium (tilladelse nr. 75-1170) og af Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; GMO-aftalenummer DUO-5291). Mus blev anbragt i dyrestalden på en 12 timers lys/mørk cyklus med en omgivelsestemperatur på 22-24 °C og fugtighed på 40%-50%. Mus, der anvendes her, omfatter kvindelig OF1 (Oncins France 1, 8 til 12 uger gammel) og kvindelig C57BL / 6 (10 til 14 uger gammel).

1. Opsamling og klargøring af oocytter

  1. Der indsamles oocytter fra 8 til 14 uger gamle mus som beskrevet i18 og19.
    1. Kort fortalt ekstraheres først æggestokke fra mus som i18 til forvarmet (37 ° C) M2 + bovin serumalbumin (BSA) medium suppleret med 1 μM Milrinone19, hvilket forhindrer genoptagelse af meiose i oocytter.
    2. Punktering ovariefollikler med kirurgiske nåle for at frigive voksende oocytter fra antrale follikler (slutningen af oocytvækst20).
    3. Der indsamles oocytter af den størrelse, der er nødvendig til forsøg (voksende og/eller fuldvoksne oocytter) med en mikropipette, der er specialiseret til opsamling af oocytter, inden de vaskes og flyttes til fade med frisk medium under mineralolie.
  2. Oocytter adskilles mekanisk fra antrale follikulære celler ved pipettering op og ned og stabiliseres i 1 time i inkubatoren ved 37 °C, inden der fortsættes med efterfølgende eksperimentelle trin.
    BEMÆRK: Oocytter opbevares ved 37 °C under alle eksperimentelle trin. Til denne protokol blev de største oocytter, som er de fuldvoksne, indsamlet.

2. Oocyt mikroinjektion

BEMÆRK: For at fange cytoskeletbaseret aktivitet i cytoplasmaet anvendes brightfield live-billeddannelse. Mikroinjektion af fluorescerende markører er derfor ikke nødvendig, og protokollen kan genoptages på trin 3. For at afbilde den nukleare kontur blev Rango, en sonde, der viste YFP-tag ved sin N-endestation og et CFP-tag ved sin C-terminal21,22, brugt. Når den er afbildet i oocytter ved 488 nm, mærker den hele kernen, undtagen nucleolus23, og viser en meget skarp nuklear kontur. For at visualisere nukleare pletter blev SRSF2-GFP (NM_011358), en markør for nukleare pletter11, brugt. Det samme medium anvendes til oocytopsamling, mikroinjektion, komplementær RNA-oversættelse og levende cellebilleddannelse.

  1. Lineariser Rango-plasmid med SfiI- eller SRSF2-GFP-plasmid med AgeI-restriktionsenzymer.
  2. Syntetiser komplementære RNA'er med loft (cRNA) med det passende in vitro-transkriptionssæt i henhold til promotoren (T3 for Rango og T7 for SRSF2-GFP) og rens dem ved hjælp af et kolonnerensningssæt som tidligere beskrevet24.
    BEMÆRK: Polyadenylat-SRSF2-GFP RNA ved hjælp af et polyadenyleringssæt for at øge cRNA-stabiliteten. To forskellige promotorer anvendes på grund af forskelle i plasmidrygraden.
  3. Mål cRNA-koncentrationer ved hjælp af et mikrovolumenspektrofotometer.
  4. Rango cRNA fortyndes til 1000 ng/μL og SRSF2-GFP cRNA til 600 ng/μL idH2O.
  5. CRNA-delprøven centrifugeres ved 4 °C i mindst 60 minutter ved 25.000 x g før mikroinjektion.
  6. Der injiceres cRNA'er, der koder for YFP-Rango eller SRSF2-GFP som beskrevet i11,25, i cytoplasmaet af oocytter i 37 °C M2+ BSA+Milrino-substrat ved hjælp af en mikroinjektor.
  7. Der inkuberes oocytter i mindst 2 timer i dyrkningsmedium ved 37 °C til cRNA-translation.
  8. Oocytter deponeres i små (5 μL) dyrkningsmediumdråber på en 35 mm vævskulturskål med dækglasbund dækket med mineralolie. Anbring en oocyt pr. dråbe for at undgå fotoblegning af nærliggende oocytter.

3. Levende cellebilleddannelse

BEMÆRK: Levende museoocytter blev undersøgt med et omvendt konfokalmikroskop udstyret med et Plan-APO 40x/1.25 NA olienedsænkningsmål, et motoriseret scanningsdæk, et inkubationskammer (37 °C), et CCD-kamera koblet til et filterhjul og en roterende skive. Billeder i høj tidsmæssig opløsning erhverves ved hjælp af Metamorph (i det følgende benævnt billedbehandlingssoftwaren) i streamoptagelsestilstand.

  1. Åbn vinduet Hent i billedbehandlingssoftwaren.
  2. Indstil eksponeringstiden til 500 ms, kameraområdet på Full Chip og binning på 1.
  3. På fanen Erhverv skal du indstille belysning for den ønskede kanal. For at afbilde cytoplasmatisk aktivitet belyses oocytter med transmitteret lys. For at afbilde kernen mærket med YFP-Rango eller SRSF2-GFP skal du belyse oocytter med en excitationsbølgelængde på 491 nm.
  4. Ved cytoplasmatisk omrøring eller YFP-Rango-eksperimenter skal du fokusere på oocytnukleolus, som let kan observeres med transmitteret lys (figur 3A). Et enkelt fly vil blive erhvervet. For nukleare speckle eksperimenter, fokus på SRSF2-GFP dråber (figur 3C).
  5. På fanen Special skal du indstille parametre for at optimere anskaffelseshastigheden som nedenfor.
    Kameralukker: Åben for eksponering
    Ryd tilstand: RYD PRESEQUENCE
  6. Åbn vinduet Stream Acquisition i billedbehandlingssoftwaren. Indstil streamingparametrene i henhold til eksperimentet. For begge undersøgelser 10,11 anvendes parametrene beskrevet nedenfor.
    1. På fanen Erhverv skal du indstille følgende parametre.
      Anskaffelsestilstand: Stream til RAM
      Antal billeder: 480 (kan reduceres til 240 billeder for at reducere billedbehandlingstiden)
      Kameraparametre: Hent billeder med billedhastighed
      Antal (Nb) billeder, der skal springes over: 0
    2. På fanen Parametre for digitalkameracontroller skal du angive følgende parametre.
      Kameratilstand: HALT
      Lukkertilstand: ÅBEN ALDRIG
      Ryd tilstand: RYD PRESEQUENCE
      Nb af rammer til gennemsnit: 1
      BEMÆRK 1: Når eksponeringstiden er indstillet i streamtilstand, bestemmes filmens varighed af antallet af billeder. For eksempel genererer 500 ms eksponeringstid og 480 billeder en film på 4 min. Der kan vises en forhåndsvisning under billedoptagelse.
  7. Juster et interesseområde (ROI) omkring objektet. Minimering af ROI-området reducerer anskaffelsestiden.
  8. Klik på Hent i vinduet Stream Acquisition for at starte filmen.
  9. Gem film som en .tif fil i slutningen af anskaffelsen.
    BEMÆRK: For at følge nukleare strukturer under film med høj tidsmæssig opløsning skal nukleare sonder (YFP-Rango og SRSF2-GFP) have et højt signal-støj-forhold for at lette segmentering af objekterne under yderligere trin i billedanalysen. Eksogene SRSF2-GFP-ekspressionsprofiler bør være sammenlignelige med endogene nukleare speckle immunfarvninger (figur 3C-D). Ændringer i SRSF2-GFP-ekspressionsprofiler i forhold til endogen farvning kan afspejle høje doser cRNA-injektion og translation26 (figur 3C-D).

4. Billedanalyse: Cytoplasmatisk omrøring

BEMÆRK: Den cytoplasmatiske omrøring, som afspejler intensiteten af actinbaseret cytoskeletal aktivitet i oocytter, bestemmes af billedkorrelationsanalyser ved hjælp af software fra en tidligere publikation af lab9 og tilgængelig på27. Softwaren måler, hvor meget pixelintensiteter der bevares mellem på hinanden følgende billeder. Outputtet er tabet af korrelation mellem billeder i tid, der starter ved 1 og falder eksponentielt med tiden, som i9.

  1. Juster rå time-lapse-billeder (Δt = 0,5 s) ved hjælp af Fiji StackReg-pluginet (Plugins>StackReg). For at installere pluginet StackReg28 skal du aktivere BIG-EPFL-opdateringswebstedet29 for at få adgang til pluginet.
  2. Beregn lysfeltbilledkorrelationer i 3 til 4 cytoplasmatiske regioner på ~ 300 μm2 ved at følge nedenstående trin.
    1. Beskær regionerne, og gem dem som separate filmfiler. Åbn vinduet Terminal.
    2. Skriv oocyt, tryk på mellemrumstasten , og tryk derefter på Enter. Der vises et vindue kaldet Signal og slot. Vælg de beskårne filmfiler, der skal analyseres.
      BEMÆRK: Flere film kan vælges på samme tid.
  3. Programmet returnerer arkiver i samme mappe som filmene. Der genereres tre forskellige filer med .csv, .eps og .xls udvidelser. Den .xls fil indeholder data til at tegne korrelationsplottene for en region. Gennemsnitlige korrelationsværdier fra forskellige områder i en celle.
  4. Af hensyn til visuel klarhed transformeres de endelige korrelationsværdier ved at trække værdien af hvert tidspunkt fra 1 for at opnå en inverteret eksponentiellignende kurve som i 11.

5. Billedanalyse: Cytoplasmatiske vektorkort

BEMÆRK: Mus oocyt cytoplasmatiske vektorkort blev genereret af Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS) plugin30 , der tidligere blev implementeret til påvisning af cytoplasmatiske strømme i museoocytter31 på Fiji 32 og tilgængelig på 33. Kortene viser cytoplasmatisk strømningshastighed, størrelse og retning, som i9 og11.

  1. Konverter tidsforløbsbilleder med lyse felter (Δt = 0,5 s) til 32-bit format.
  2. Juster billeder med Fiji StackReg-pluginet i Plugins > StackReg , og vælg Stiv kropstransformation .
  3. Med plugin-stakken trækker glidende gennemsnit jru v2 (i Detrend-værktøjer i STICS-plugins-pakken), slippe af med stationære strukturer i filmen ved at trække det tidsgennemsnitlige billede af filmen. Afkrydsningsfelter Træk statisk gennemsnit og output Sub Stack, vælg Bevar rumligt gennemsnit og indstil periode på 5.
  4. Tegn et investeringsafkast omkring oocytten, undtagen cortex for at undgå kanteffekter af pluginet.
  5. Start STICS map jru V2 plugin (i ICS-værktøjer), med subregion størrelse på 32 pixels, trinstørrelse på 16 pixels, STICS tidsmæssige forskydning af 3, X og Y forskydninger på 0, hastighed multiplikator på 8, størrelsesorden tærskel på 0 og afkrydsningsfelter af Normalize Vector Length, Center Vectors, Output Velocities og Use Movie Mask.
    BEMÆRK: Pluginet genererer et kort over oocytten i .tif format, der viser cytoplasmatiske strømme som vektorer med farver, der angiver flowamplituder, som i9 og11, og en excel-fil med målte strømningshastigheder.

6. Billedanalyse: Udsving i nuklear disposition

BEMÆRK: Nukleare konturfluktuationer, der afspejler kernemembranomrøring, kan bestemmes ud fra film af kerner mærket med YFP-Rango (figur 4A, C). Billedanalyse for nukleare konturudsving kræver Fiji og installation af plugins StackReg (aktiver BIG-EPFL-opdateringswebstedet29 for at få adgang til StackReg-pluginet), PureDenoise34 og Ovocyte_nucleus. StackReg-pluginet udfører billedregistrering for at korrigere for mulig global bevægelse. PureDenoise-pluginet fjerner støj fra flerdimensionelle billeder, der er ødelagt af blandet Poisson-Gaussisk støj og udjævner den nukleare kontur. Ovocyte_nucleus-pluginet tærer signalet og fylder hullet svarende til kernen for at skabe en binær kernemaske, justere den med StackRreg og beregne afstanden r fra kernemaskens centroid til maskens omkreds for alle θ-vinkler (θ° fra 0° til 360° med 1° trin), som i figur 4. Alle koder til disse plugins kan findes på 35.

  1. På Fiji skal du i menuen Plugins > CIRB > Verlhac vælge Ovocyte Nucleus Shape.
  2. Udfør følgende valg i dialogboksen.
    1. Vælg den mappe, der indeholder de film, der skal analyseres.
    2. Vælg θ-vinklen (en værdi fra 1° til 360° kan vælges, og en værdi på 1° blev brugt til optimal konturopløsning), margenerne til beskæring (5 μm anbefales for at holde hele kernen).
    3. Vælg XY-kalibrering og tidsinterval. Klik på OK.
      BEMÆRK: Resultaterne leveres som .xls filer i en out-mappe i mappen med de originale film. Denne fil viser alle målte radier r for hver gang t og hver vinkel θ. Et eksempel på outputfil findes i supplerende tabel 1. Ud-mappen indeholder også en film af kernemasken.
  3. Brug et regneark til at beregne middelradius R over alle tidspunkterne t for hver defineret θ-vinkel. Dette gør det muligt at plotte middelformen over tid (figur 4B). Se eksempel i supplerende tabel 2.
  4. For hver t og θ trækkes middelradius R over tid fra radius r. Variansen (r-R)2 er et mål for nukleare kuvertfluktuationer.
  5. Beregn gennemsnittet af fluktuationerne for alle tidspunkter t og alle vinkler θ for hver kerne og til sidst for alle kerner fra en betingelse.
    BEMÆRK: Når formen af kerner ændres signifikant, som i tilfælde af et forstyrret cytoskelet, roteres kerner mærket med YFP-Rango på Fiji for at orientere den glatte del op og invaginationen ned, inden man fortsætter med analyse af nukleare konturfluktuationer, som i10.

7. Billedanalyse: Nukleare specklebevægelser (diffusiv dynamik)

BEMÆRK: Nuklear speckle bevægelsesanalyse gør det muligt at udlede typen af dynamik (drevet, diffus eller begrænset) af disse organeller fra deres spor.

  1. Vælg stream-mode billeder af oocytter, der udtrykker SRSF2-GFP dråber, der primært bevæger sig i X-Y-aksen.
  2. Korrekt til blegning af time-lapse-billeder af oocytter, der udtrykker SRSF2- GFP ved hjælp af histogrammatchningsmetoden i Fiji (Image > Adjust > Bleach Correction).
  3. Juster billeder igen med Fiji StackReg-plugin'et.
  4. Spor SRSF2-GFP-dråbecentre ved hjælp af Fiji Manual Tracking-plugin (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Tryk på Tilføj spor for at starte sporingen, og tryk på Afslut spor , når du er færdig. Aktivér ikke centreringskorrektion.
  5. Kopiér spor til en regnearksfil for at fortsætte med tidsmæssige beregninger af middelkvadratforskydninger (MSD) som i 11, og beregn tidsmæssige muskel- og skeletbesvær ud fra hver dråbebane på 20 s.
  6. Tilpas kurver (msd(t) = beta x tα) med Nelder-Mead-metoden ved hjælp af R-software til at estimere diffusionseksponenten alfa (α).
  7. Den effektive diffusionskoefficient måles for at kunne sammenligne de forskellige forhold, da diffusionen forventes at være unormal (α< 1).
  8. Den effektive diffusionskoefficient Deff beregnes ud fra en lineær tilpasning (alpha=1) på de 40 første punkter (20 s) i den tidsmæssige MSD-kurve, og der normaliseres dråbestørrelse (Deff i μm2/s x 3/2 πr i μm).

8. Billedanalyse: Udsving i nuklear speckleoverflade

BEMÆRK: Nuklear speckle konturudvikling i tid, en aflæsning af aktiv kraftoverførsel på disse organeller, blev målt med et specialbygget plugin Radioak36 til brug i Fiji og tilgængelig på37. Pluginet udtrækker værdierne for radier for en given markering for alle vinkler omkring markeringscentret. Formvariation over tid blev målt ved at sammenligne værdien af radius i forhold til dens gennemsnitlige værdi for hver vinkel. Pluginet gør det muligt at kvantificere formudsvingene og giver mulighed for at visualisere denne dynamik. For at installere det skal du downloade Radioak_.jar filen og placere den i plugins-mappen i Fiji. Genstart Fiji. Dette plugin er en opdateret version af pluginet, der bruges til at analysere nukleare konturudsving ovenfor og implementere en sammenlignelig rørledning.

  1. I streamfilm af SRSF2-GFP-dråber skal du vælge større dråber af sammenlignelige størrelser (radius ~ 2,5 μm).
    BEMÆRK: Hvis dråberne er for små, vil utilstrækkelig opløsning føre til afvigende overfladeudsvingsmålinger.
  2. Beskær timelapse-billeder af dråber, der spænder over 15 s (Δt = 0,5 s) ved at tegne et rektangel rundt om dråben, og vælg Billede > Beskær (figur 5).
  3. Juster billeder med Fiji StackReg-pluginet i Plugins > StackReg , og vælg Stiv kropstransformation .
  4. Udjævn billedet for at fjerne støj omkring dråben ved hjælp af indstillingen Fiji Udjævn under Proces.
  5. Opret binær maske af dråbe ved hjælp af indstillingen Konverter til maske i Fiji under Process > Binary. Brug standardmetoden og mørk til baggrund (figur 5).
  6. Analysér den genererede binære dråbemaske ved hjælp af indstillingen Analysér partikler i Fiji under Analysér, vælg Ryd resultater og Føj til Manager-indstillinger , og gem interesseområdet (ROI'er) i RoiManager (Mere > Gem) i zip-format, der skal læses af Radioak. ROI'erne skal gemmes i en mappe kaldet konturer i den samme mappe i filmene, i filer kaldet imagename_UnetCortex.zip for hver film, der skal findes af Radioak.
  7. I menuen Fiji Plugins > CIRB > Radioak skal du vælge enten Hent Radii for kun at behandle én film eller Do One Folder for at analysere alle film i den samme mappe.
    BEMÆRK: Der vises et vindue for at vælge vinkelnummer og skala. Radioak blev opsendt med 1° vinkeltrin fra 0° til 360° (input på 360), og radiiværdierne blev ekstraheret.
  8. Vælg filmen eller mappen med de film, der skal analyseres. Resultaterne leveres som .xls filer (en for hver film) i en radioakres-mappe i mappen med de originale film. Hver fil viser alle målte radier r (i μm, hvis skalaparameteren blev udfyldt) for hver gang t (i udsnit) og hver vinkel (i radianer; Figur 5; se eksempel på .xls output i supplerende tabel 3).
  9. I regnearket beregnes middelradius R over alle tidspunkterne t for hver defineret vinkel (se eksemplet i supplerende tabel 4). Dette gør det muligt at plotte den gennemsnitlige form over tid.
  10. Variansen (r-R)2 afbildes i μm2 , hvilket svarer til målet for dråbeoverfladefluktuationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Billedpaneler i figur 3 viser eksempler på en typisk fuldvoksen oocyt (figur 3A), nukleoplasmaet i en fuldvoksen oocyt, der udtrykker YFP-Rango (figur 3B), nukleoplasmaet i en fuldt voksen oocyt, der udtrykker en korrekt (venstre panel; Figur 3C) eller et overdrevent (højre panel; Figur 3C) dosis af SRSF2-GFP cRNA og en immunfarvning af nukleare pletter i en fuldt udvokset oocyt under anvendelse af SC35-antistoffet (figur 3D). Den korrekte dosis SRSF2-GFP cRNA til mikroinjektion blev defineret baseret på visuelle sammenligninger mellem ekspressionsprofiler af SRSF2-GFP med endogene profiler af nukleare pletter.

Cytoplasmatiske omrøringskræfter i oocytter, som vist ved tidligere arbejde fra laboratoriet ved hjælp af STICS-vektorkort og billedkorrelationsanalyse (se9 og11), kan reduceres ved cytoskeletale forstyrrelser, både genetiske (f.eks. FMN2-mutant mus) og kemiske (f.eks. Cytochalasin D). STICS-kort over kontroloocytter viser adskillige vektorer med farver, der angiver høje strømningshastigheder, mens kort over oocytter med forstyrrede cytoskeletale kræfter viser mindre vektorer, med farver, der angiver lave strømningshastigheder. På samme måde går billedkorrelation meget hurtigt tabt i kontroloocytter sammenlignet med oocytter med forstyrrede cytoskeletale kræfter. Dette kan observeres på korrelationskurver med et hurtigere fald i kurven for kontroloocytter sammenlignet med oocytter med forstyrrede cytoskeletale kræfter9 eller en hurtigere stigning, når kurven inverteres11.

Cytoskeletale kræfter agiterer kernen og dens indre organeller, især nukleare kondensater som nukleare pletter10,11. I figur 4A udsættes kernen af kontroloocytter for vigtige perifere udsving, hvilket er synligt ved anvendelse af atomsonden YFP-Rango. Kerneformen i oocytter med forstyrrede cytoskeletale kræfter er stabil over tid (figur 4C). Analyse af nukleare konturfluktuationer er nøglen til præcist at kvantificere agitationen. Ved at bestemme variansen af afstanden fra kernecentroiden til dens periferi, (r-R)2 (figur 4B), kunne fluktuationer kvantificeres, hvilket viser, at nuklear agitation er 6 gange højere i kontroloocytter end i oocytter med forstyrrede cytoskeletale kræfter10. I figur 5A-B vises nukleare pletter (SRSF2-GFP + dråber) i kontrol og forstyrrede sammenhænge af cytoplasmatiske kræfter ved høj tidsmæssig opløsning. I kontroller svinger dråbeoverfladen betydeligt mere end dråbeoverflader i oocytter med forstyrrede cytoplasmatiske kræfter, som kan visualiseres og kvantificeres ved hjælp af Radioak32-pluginet. Visuelt angiver grønne og røde farver (Radioak-output set på nederste billeder af figur 5A-B) vinkler, hvor pluginet registrerede overfladeændringer mellem på hinanden følgende billeder og hvid indikerer mangel på overfladeændringer.

Figure 1
Figur 1: Illustration af sen museoogenese og tidlig embryogenese. Illustration af kernecentrering, der forekommer i sen oocytvækst, kromosom off centrering, der opstår under oocytdeling, og tidlige trin (1-celle og 2-celle stadier) af embryogenese. De kvindelige genomer (oocytkerne og kvindelig pronucleus) er i pink, den mandlige pronucleus er i blå. Embryokernerne (efter fusion af forældregenomer) er lilla. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Illustration af cytoplasmatisk og nuklear remodellering på tværs af skalaer i voksende museoocytter. Denne figur opsummerer nøgleresultater fra 9,10,11. Illustration af actomyosinbaseret remodellering af cytoplasmaet, nuklear agitation og funktionel nuklear biomolekylær kondensatremodellering på tværs af spatiotemporale skalaer. Den skalakrydsende remodellering af nukleare pletter forbedrer biomolekylære reaktioner forbundet med deres funktion (dvs. splejsning af præ-mRNA). Bemærk, at denne protokol kun tillader vurdering af nuklear agitation på tværs af rumlige skalaer, men ikke tidsmæssige, da al billeddannelse udføres med den samme tidsmæssige opløsning på 0,5 s mellem billedrammer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Prøvebilleder af den fuldvoksne oocyt og nukleoplasmaet. (A) Bright-field billede af en fuldvoksen oocyt, der viser kromatin (cyan), der omkranser kernen. En prikket hvid cirkel skitserer kernen. B) levende oocytkerne, der udtrykker YFP-Rango Bemærk fraværet af fluorescens i kernen. C) Eksempel på levende oocytkerne, der udtrykker SRSF2-GFP efter mikroinjektion af korrekte doser cRNA (venstre panel) eller høje doser cRNA (højre panel) Bemærk de kondenserede (dråbe) og opløste faser til venstre og deres fravær i tilstanden til højre. D) nuklear speckle immunfarvning i en fast oocyt Bemærk den endogene udtryksprofil, der kan sammenlignes med den i C (venstre panel). Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Plugin-output af kontrol og forstyrrede nukleare konturfluktuationer. (A) Time-lapse af en kontroloocytkerne, der udtrykker YFP-Rango (øverst) og dens tilsvarende binære maske genereret af Ovocyte_nucleus-pluginet (nederst). (B) Princippet om nukleare konturfluktuationer målinger over tid og i en given retning. Retninger defineres ved en drejevinkel θ på 1° trin fra 0° til 360°. To repræsentative former ved t = 0 s (gul) og t = 135 s (lilla) er repræsenteret. Den blå form svarer til middelformen over tid. (C) Nukleare konturfluktuationer af en kerne i en oocyt med nedsat cytoskeletale kræfter på grund af forstyrrelse af både F-actin (FMN2-mutant mus) og mikrotubuli (Nocodazol-behandling; som i10). Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Plugin-output af kontrol og forstyrrede dråbeoverfladeudsving. (A) Beskæring af en kontrol SRSF2-GFP nuklear dråbe afbildet med 500 ms pr. ramme og vist i Ice Look Up Table (LUT) (øverst); binær maske af samme dråbe genereret af Fiji (center); og Radioak-plugin-output efter analyse af overfladeudsving i dråben (bunden), med grøn og rød, der angiver vinkler, hvor pluginet registrerede overfladeændringer mellem på hinanden følgende billeder og hvidt, hvilket indikerer mangel på overfladeændringer. (B) Overfladeudsving af en nuklear dråbe i oocytter med nedsat cytoskeletale kræfter på grund af forstyrrelse af både F-actin og mikrotubuli (som i11). Skalabjælker = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel 1: Eksempel på Ovocyte_nucleus plugin-analyseoutput. Den samme kerne analyseret som den, der er vist i figur 4A. Theta (θ) er vinklen i grader, og t1 til t600 svarer til rammenummeret, som kan konverteres i tid. Radierne er i μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 2: Eksempel på regneark anvendt til beregning af nukleare kontursvingninger. Den samme kerne analyseret som den, der er vist i figur 4A. Theta (θ) er vinklen i grader, og t1 til t600 svarer til rammenummeret, som kan konverteres i tid. Tab Raw og gennemsnit: Radierne er i μm. Tab r-R: R-R-afstandene er i μm. Tabel (r-R)2: Udsvingsværdierne er i μm2. Fanerne x og y svarer til de kartesiske koordinater for radierne fra fanen Rå og gennemsnit. De gør det muligt at tegne kernens middelform over tid i fanen Gennemsnitlig form. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 3: Eksempel på output fra Radioak-pluginanalyse. Den samme dråbe analyseret som den, der er vist i figur 5A. De målte radier på forskellige tidspunkter og vinkler vises. Radierne er i μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 4: Eksempel på regneark anvendt til beregning af udsving i kernedråbeoverfladen. Den samme dråbe analyseret som den, der er vist i figur 5A. Theta (θ) er vinklen i grader, og t1 til t600 svarer til rammenummeret, som kan konverteres i tid. Tab Raw og gennemsnit: Radierne er i μm. Tab r-R: R-R-afstandene er i μm. Tabel (r-R)2: Udsvingsværdierne er i μm2. Fanerne x og y svarer til de kartesiske koordinater for radierne fra fanen Rå og gennemsnit. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøgletrin i denne protokol inkluderer korrekt mikroinjektion af oocytter uden at påvirke deres overlevelse eller normale funktion 9,10,11 samt mikroinjektion af foruddefinerede mængder cRNA, der muliggør korrekt visualisering af relevante strukturer, såsom nukleare pletter.

Etablering af forbindelsen mellem cytoplasmatisk og (intra) nuklear dynamik er afgørende, når man studerer, hvordan cytoskelettet agiterer kernen eller dens indre. Denne protokol, med små modifikationer, tillader det ved at korrelere cytoplasmatiske omrøringsintensiteter til nuklear YFP-Rango eller SRSF2-GFP dråbedynamik (som i11). For at fortsætte skal oocytter først filmes i 120 s i lysfelttilstand for at fange cytoplasmatisk omrøring, inden de straks filmes i 120 s med en 491 nm laser for at fange nuklear kontur eller dråbedynamik. I tilfælde af nukleare SRSF2-GFP-dråber kan korrelationen simpelthen vurderes ved at sammenligne deres effektive diffusionskoefficienter (se trin 7 i denne protokol) med de inverterede maksimale intensitetsværdier for cytoplasmatisk omrøring opnået ved hjælp af billedkorrelationsanalyser (se trin 4 i denne protokol). Et andet vigtigt punkt er størrelsen af kondensater, der vælges til analyser af dråbeoverfladeudsving. Dråber med en lignende diameter bør udvælges til komparative analyser for at forhindre bias, da størrelsen modulerer intensiteten af overfladeudsving.

Der er nogle begrænsninger for denne protokol. Analyser af nukleare konturudsving er afhængige af fuld intranuklear farvning, såsom YFP-Rango eller NLS-GFP. For analyser af nukleare pletter kan mikroinjektion af for store mængder SRSF2-GFP cRNA føre til tilsyneladende ændringer i faseseparerende egenskaber af denne kondensatmarkør (figur 3C), som tidligere gennemgået af andre26. Det er derfor afgørende at kontrollere, at eksogene proteinekspressionsprofiler er sammenlignelige med de endogene. Desuden bør relativt små dråber (<2 μm radius) udelukkes fra pipelines til analyse af overfladeudsving på grund af begrænsninger i rumlig opløsning med de værktøjer, der er defineret her. Dette løsningsproblem kan normalt løses ved hjælp af mere resolutive mikroskoper, som for eksempel kan være nødvendige for at undersøge overfladeudsving af mindre kondensater i oocytkernen eller i den signifikant mindre kerne i somatiske celler.

Samlet set tillader denne protokol indfangning af actin og mikrotubulus cytoskeletbaseret agitation af museoocytkernen på tværs af skalaer. Specifikt tillader det dokumentation af cytoskeletbaseret mobilisering af cytoplasmaet, nukleare konturfluktuationer sammen med væskelignende nukleare speckleforskydninger og overfladefluktuationer. Selvom nogle undersøgelser i andre celletyper adresserer nogle af disse spørgsmål 38,39,40 via forskellige protokoller af varierende kompleksitet på individuelle rumlige skalaer, giver denne enkle protokol de nødvendige værktøjer til at adressere den nævnte cellulære dynamik på tværs af flere skalaer i en enkelt arbejdspipeline for første gang. Desuden muliggør data genereret fra denne tilgang, når de suppleres med biofysisk modellering som i 10,11, en minimalt invasiv evaluering af: i) ændringer i nuklear mekanik10; ii) overførsel af cytoskeletbaserede aktive kræfter i cytoplasmaet til kondensater i kernen11; og iii) spredningen af denne aktive energi på tværs af forskellige cellulære rum10,11. Det er vigtigt, at denne protokol er alsidig, da den ikke kun kan tilpasses andre nukleare kondensater som nucleolus23, men også til andre celletyper som kræftceller, hvor ændringer i både cytoskeletal og nuklear kondensatadfærd blev dokumenteret 17,41.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

A.A.J. og M.A. skrev manuskriptet i fællesskab, og alle medforfattere kommenterede manuskriptet. MA støttes af CNRS og "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. støttes af Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel og Fondation du Collège de France.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A3311
CSU-X1-M1 spinning disk Yokogawa
DMI6000B microscope  Leica
Femtojet microinjector Eppendorf
Fiji
Filter wheel Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish World Precision Instruments FD35-100
Metamorph software  Universal Imaging,  version 7.7.9.0
Mineral oil Sigma Aldrich M8410-1L
NanoDrop 2000  Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice  Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit  Thermo Fisher AM1350
Retiga 3 CCD camera  QImaging
RNAeasy kit  Qiagen 74104
SC35 antibody Abcam ab11826 Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid   OriGene Technologies MG202528 NM_011358
Stripper Micropipette  XLAB Solutions specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine Thermo Fisher AM1384 
T7 mMessage mMachine  Thermo Fisher AM13344
Thermostatic chamber Life Imaging Service
Windows Excel Windows

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030 (2015).
  3. Gundersen, G. G., Worman, H. J. Nuclear positioning. Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).
  4. Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
  5. Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
  6. Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
  7. Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
  8. Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
  9. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
  10. Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
  11. Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070 (2022).
  12. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382 (2017).
  13. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  14. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  15. Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
  16. Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
  17. Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
  18. Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
  19. Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
  20. El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
  21. Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
  22. Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  23. Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
  24. Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
  25. Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
  26. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  27. OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
  28. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  29. ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
  30. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  31. Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  33. Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
  34. Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
  35. Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
  36. Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
  37. ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
  38. Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
  39. Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101 (2018).
  40. Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
  41. Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. Biomolecular condensates and cancer. Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 203
Indfangning af cytoskeletbaseret agitation af museoocytkernen på tværs af rumlige skalaer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Letort, G., Mailly, P., Al Jord, A., … More

Letort, G., Mailly, P., Al Jord, A., Almonacid, M. Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (203), e65976, doi:10.3791/65976 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter