In vivo Kalciumavbildning av sensoriska neuroner i råttans trigeminusganglion

Summary

Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) möjliggör en robust analys på populationsnivå av sensorisk neuronsignalering. Här har vi utvecklat ett nytt tillvägagångssätt som möjliggör in vivo GECI-visualisering av neuronaktivitet hos trigeminusganglier hos råtta.

Abstract

Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) möjliggör avbildningstekniker för att övervaka förändringar i intracellulärt kalcium i riktade cellpopulationer. Deras stora signal-brusförhållande gör GECI:er till ett kraftfullt verktyg för att detektera stimulusframkallad aktivitet i sensoriska neuroner. GECI underlättar analys på populationsnivå av stimulus som kodar för antalet neuroner som kan studeras samtidigt. Den här populationskodningen görs lämpligast in vivo. Dorsalrotsganglierna (DRG), som hyser soma av sensoriska neuroner som innerverar somatiska och viscerala strukturer under nacken, används mest i stor utsträckning för in vivo-avbildning eftersom dessa strukturer är relativt lätta att komma åt. På senare tid har denna teknik använts på möss för att studera sensoriska nervceller i trigeminusgangliet (TG) som innerverar orala och kraniofaciala strukturer. Det finns många skäl att studera TG utöver DRG, inklusive den långa listan över smärtsyndrom som är specifika för orala och kraniofaciala strukturer som verkar återspegla förändringar i sensorisk neuronaktivitet, såsom trigeminusneuralgi. Möss används mest i stor utsträckning i studier av DRG- och TG-neuroner på grund av tillgången på genetiska verktyg. Men med skillnader i storlek, enkel hantering och potentiellt viktiga artskillnader finns det skäl att studera TG-neuroner från råttor snarare än möss. Således utvecklade vi ett tillvägagångssätt för att avbilda TG-neuroner från råttor in vivo. Vi injicerade neonatala valpar (p2) intraperitonealt med en AAV-kodande GCaMP6s, vilket resulterade i >90% infektion av både TG- och DRG-neuroner. TG visualiserades hos den vuxne efter kraniotomi och decortication, och förändringar i GCaMP6s fluorescens observerades i TG-neuroner efter stimulering av underkäks- och maxillära regioner i ansiktet. Vi bekräftade att ökningar av fluorescens framkallades av stimulus vid perifer nervblockad. Även om detta tillvägagångssätt har många potentiella användningsområden, använder vi det för att karakterisera subpopulationen (erna) av TG-neuroner som förändrats efter perifer nervskada.

Introduction

Somatosensation, den neurala kodningen av mekaniska, termiska och kemiska stimuli som påverkar huden eller andra kroppsstrukturer, inklusive muskler, ben och inälvor, börjar med aktivitet i primära afferenta neuroner som innerverar dessa strukturer¹. Elektrofysiologiska metoder baserade på en enhet har gett en mängd information om de afferenta subtyper som är involverade i denna process samt hur deras stimulus-responsegenskaper kan förändras över tid ^1,2,3. Men även om det fortfarande finns starka bevis till stöd för teorin om märkta linjer, som föreslår att specifika sensoriska modaliteter förmedlas av specifika subpopulationer av neuroner, tyder förmågan hos många subpopulationer av neuroner att svara på samma typer av mekaniska, termiska och kemiska stimuli på att majoriteten av somatosensoriska stimuli kodas av flera subpopulationer av neuroner^{4, 5}. veckor Således kommer en bättre förståelse av somatosensation endast att komma med möjligheten att studera aktiviteten hos 10-tals, om inte hundratals, neuroner samtidigt.

Framsteg inom optiska metoder med den relativt nya tillkomsten av konfokala och därefter multifoton- och digitala avbildningstekniker har underlättat möjligheten att utföra relativt icke-invasiva populationsnivåanalyser av neuronal aktivitet ^6,7. Ett av de sista hindren i tillämpningen av denna teknik har varit utvecklingen av verktyg för att möjliggöra optisk bedömning av neural aktivitet. Med tanke på hastigheten hos en aktionspotential som kan börja och sluta på mindre än en millisekund, skulle ett spänningskänsligt färgämne med kapacitet att följa förändringar i membranpotentialen med hastigheten av en aktionspotential vara det perfekta verktyget för detta ändamål. Men även om det har skett enorma framsteg inom detta område 7,8,9,10, är signal-brusförhållandet för många av dessa färgämnen fortfarande inte tillräckligt högt för att möjliggöra en populationsanalys av hundratals neuroner på encellsnivå. Som ett alternativt tillvägagångssätt har utredarna vänt sig till att övervaka förändringar i intracellulär Ca²⁺-koncentration ([Ca²⁺]_i). Begränsningarna med denna strategi har varit tydliga från början och inkluderar det faktum att en ökning av [Ca²⁺]_i är ett indirekt mått på neural aktivitet¹¹; att en ökning av [Ca²⁺]_i kan inträffa oberoende av Ca²⁺-inflöde i samband med aktivering av spänningsstyrda Ca²⁺-kanaler (VGCC)^12,13; att storleken och varaktigheten av en Ca²⁺-transient kan styras av processer som är oberoende av VGCC-aktivitet 11,12,14; och att tidsförloppet för Ca²⁺ transienter vida överstiger det för en aktionspotential¹⁵. Ändå finns det ett antal betydande fördelar förknippade med användningen av Ca²⁺ som ett indirekt mått på neural aktivitet. Inte minst av dessa är signal-brusförhållandet som är associerat med de flesta Ca²⁺-indikatorer, vilket återspeglar både storleken på förändringen i intracellulärt Ca²⁺ och det faktum att signalen härrör från cytosolens tredimensionella utrymme snarare än cellmembranets tvådimensionella utrymme. Dessutom, med utvecklingen av genetiskt kodade Ca²⁺-indikatorer (GECI), är det möjligt att dra nytta av genetiska strategier för att driva uttrycket av Ca²⁺-indikatorerna i specifika subpopulationer av celler, vilket underlättar analyser på populationsnivå i intakta preparat (t.ex. se¹⁶).

Med tanke på det antal genetiska verktyg som nu finns tillgängliga på möss borde det inte vara någon överraskning att GECI:er har använts mest i denna art. Muslinjer med konstitutivt GECI-uttryck i subpopulationer av sensoriska neuroner har utvecklats ^7,16,17. Med utvecklingen av muslinjer som uttrycker rekombinaser i specifika celltyper är det möjligt att använda ännu mer sofistikerade strategier för att kontrollera GECI-uttryck¹⁵. Men även om dessa verktyg blir allt kraftfullare finns det ett antal skäl till varför andra arter, som råttor, kan vara mer lämpliga för vissa experimentella frågor. Dessa inkluderar den större storleken, vilket underlättar ett antal experimentella manipulationer som är svåra, om inte omöjliga, i den mindre musen; hur lätt det är att träna råttor i relativt komplexa beteendeuppgifter; och åtminstone vissa bevis för att biofysiska egenskaper och uttrycksmönster för flera jonkanaler i sensoriska neuroner hos råttor kan vara mer lika de som observerats i mänskliga sensoriska neuroner än samma kanaler i mus i förhållande till de mänskliga¹⁸.

Medan transduktionen av somatosensoriska stimuli i allmänhet sker i de perifera terminalerna av primära afferenter, måste aktionspotentialen som initieras i periferin passera genom strukturen som rymmer primära afferenta somata, kallad dorsal rot (DRG) eller trigeminusganglier (TG) innan den når det centrala nervsystemet¹⁹. Även om det finns bevis för att inte alla aktionspotentialer som fortplantar sig längs en primär afferent axon kommer att invadera cellkroppen²⁰, en konsekvens av det faktum att de primära afferenta somata är anslutna till den huvudsakliga afferenta axonen via en T-övergång¹⁹, verkar majoriteten av aktionspotentialerna som initieras i periferin invadera soma²¹. Detta ger tre experimentella fördelar vid användning av GECI för att bedöma populationskodning i primära afferenter: den stora storleken på cellkroppen i förhållande till axonerna ökar ytterligare signalen till brus när man använder [Ca²⁺]_i som ett indirekt mått på afferent aktivitet; DRG är i allmänhet lätta att komma åt. Och genom att bedöma aktiviteten på en plats som är rumsligt avlägsen från de afferenta terminalerna minimeras den potentiella effekten av den kirurgi som behövs för att exponera ganglierna på stimulus-responsegenskaperna hos de afferenta terminalerna. Men eftersom TG finns under hjärnan (eller ovanför paletten) är de mycket svårare att komma åt än DRG. Dessutom, även om det finns många likheter mellan DRG- och TG-neuroner, finns det också en växande lista över skillnader. Detta inkluderar den grovt somatotopiska organisationen av neuroner i TG²², unika strukturer som innerveras, olika centrala terminala termineringsmönster 23,24,25,26, och nu en växande lista över skillnader i både genuttryck^27,28 och funktionellt receptoruttryck²⁹. Dessutom, eftersom vi är intresserade av att identifiera perifera mekanismer för smärta, tyder det relativt stora antalet smärtsyndrom som verkar vara unika för trigeminussystemet (t.ex. migrän, trigeminusneuralgi, brännande munsyndrom) som verkar involvera avvikande aktivitet i primära afferenter 30,31,32, på att TG måste studeras direkt.

Således, medan stimulus-responsegenskaper hos TG-neuroner har studerats med GECIs i mus¹⁶, eftersom de skäl som anges ovan tyder på att råttan kan vara en mer lämplig art för att ta itu med en mängd olika experimentella frågor, var syftet med denna studie att utveckla ett tillvägagångssätt för att använda GECIs för att studera TG-neuroner hos råtta. För att uppnå detta använde vi ett viralt tillvägagångssätt för att driva uttrycket av GECI GCaMP6s i det perifera nervsystemet. Vi tog sedan bort framhjärnan för att ge tillgång till TG. Slutligen applicerades mekaniska och termiska stimuli på ansiktet medan neuronala svar bedömdes under fluorescerande mikroskopi. Tillsammans stöder dessa data en roll för att använda råttan för att undersöka förändringar i TG under många stater, vilket utökar verktygslådan för forskare som är intresserade av sensorisk kodning i trigeminussystemet.

Protocol

Alla experiment som involverar användning av djur i forskning utfördes i enlighet med standarder som lagts fram av National Institutes of Health och International Association for the Study of Pain och godkändes av University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22051100). I slutet av varje experiment avlivades råttor genom exanguination med hjärtperfusion av iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS), ett tillvägagångssätt som godkänts av American Veterinary Medical Association och …

Representative Results

Eftersom vi tidigare har haft framgång med AAV9-serotypen för infektion av sensoriska nervceller hos råtta15, använde vi denna serotyp för uttryck av GCaMP6 i TG-neuroner hos råtta. Vi försökte därför först bedöma effektiviteten av sensoriska neuroninfektioner hos AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP) när detta virus administrerades till neonatala råttungar20. Detta virus använder CAG-promotorn, som driver och upprätthåller höga nivåer av genuttryck. De…

Discussion

Här demonstrerar vi ett snabbt, icke-invasivt sätt att generera en GECI-råtta för avbildning av TG. Vi valde en CAG-promotor för att driva och upprätthålla höga nivåer av genuttryck. Medan tidigare studier tyder på att andra AAV-serotyper effektivt kan driva genuttryck i DRG-neuroner³⁹, överensstämmer våra resultat med en nyligen genomförd studie som involverar intraperitoneal injektion av AAV hos nyfödda³², vilket indikerar att AAV9-serotypen är mycket effe…

Materials

AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s virus
ACEpromazine maleate	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
AnaSed (Xylazine) injection	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 Electronics box	Leica	11 888 820	Power Supply
Cutwell burr drill bit	Ransom & Randolph		¼ round
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	Base Stand
EL6000	Leica	EL6000	Light source with 120 W mercury bulb
Forceps	FST	11252-00	Dumont No. 05
Friedman rongeurs	FST	16000-14	2.5 mm cup size
Friedman-Pearson rongeurs	FST	16021-14	1 mm cup size
Heating pad (Temperature therapy pad)	STRYKER	8002-062-022
Ketamine hydrochloride	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD
Power handle high-temp cautery pen	Bovie	HIT1	handheld Change-A-Tip cautery pen
Prime 95B	Photometrics	Prime 95B	CMOS Camera
Saline	Fisher Scientific	NC0291799	0.9% Sterile Saline
Scalpel blade	Fisher Scientific	22-079-701	size 15 disposable blade
Spatula	BRI	48-1460	brain spatula
Spring scissors	FST	91500-09	Student Vannas, 5 mm cutting edge
Spring scissors	FST	15012-12	Noyes, 14 mm cutting edge
STP6000 Smart touch panel	Leica	11 501 255	Control Panel
Syringe	Hamilton	80201	25 μL Model 1702 Luer Tip syringe
Water heater	Adroit	HTP-1500