इन-वीवो चूहा ट्राइजेमिनल नाड़ीग्रन्थि में संवेदी न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग
Summary
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) संवेदी न्यूरॉन सिग्नलिंग के एक मजबूत, जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण को सक्षम करते हैं। यहां, हमने एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया है जो चूहे ट्राइजेमिनल गैन्ग्लिया न्यूरॉन गतिविधि के विवो जीईसीआई दृश्य में अनुमति देता है।
Abstract
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) लक्षित सेल आबादी में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम में परिवर्तन की निगरानी के लिए इमेजिंग तकनीकों को सक्षम करते हैं। उनका बड़ा सिग्नल-टू-शोर अनुपात जीईसीआई को संवेदी न्यूरॉन्स में उत्तेजना-विकसित गतिविधि का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है। जीईसीआई न्यूरॉन्स की संख्या के साथ उत्तेजना एन्कोडिंग के जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करते हैं जिनका एक साथ अध्ययन किया जा सकता है। यह जनसंख्या एन्कोडिंग विवो में सबसे उपयुक्त रूप से किया जाता है। पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी), जो गर्दन के नीचे दैहिक और आंत संरचनाओं को संक्रमित करने वाले संवेदी न्यूरॉन्स के सोमा का घर है, विवो इमेजिंग में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है क्योंकि इन संरचनाओं को अपेक्षाकृत आसानी से एक्सेस किया जाता है। हाल ही में, इस तकनीक का उपयोग चूहों में ट्राइजेमिनल गैंग्लियन (टीजी) में संवेदी न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए किया गया था जो मौखिक और क्रानियोफेशियल संरचनाओं को संक्रमित करते हैं। डीआरजी के अलावा टीजी का अध्ययन करने के कई कारण हैं, जिसमें मौखिक और क्रानियोफेशियल संरचनाओं के लिए विशिष्ट दर्द सिंड्रोम की लंबी सूची शामिल है जो संवेदी न्यूरॉन गतिविधि में परिवर्तन को दर्शाती है, जैसे कि ट्राइजेमिनल न्यूराल्जिया। आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता के कारण डीआरजी और टीजी न्यूरॉन्स के अध्ययन में चूहों का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। हालांकि, आकार में अंतर, हैंडलिंग में आसानी और संभावित रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के अंतर के साथ, माउस टीजी न्यूरॉन्स के बजाय चूहे का अध्ययन करने के कारण हैं। इस प्रकार, हम विवो में इमेजिंग चूहा टीजी न्यूरॉन्स के लिए एक दृष्टिकोण विकसित. हमने नवजात पिल्ले (पी 2) को एएवी एन्कोडिंग GCaMP6s के साथ इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट किया, जिसके परिणामस्वरूप टीजी और डीआरजी न्यूरॉन्स दोनों का >90% संक्रमण हुआ। टीजी क्रैनियोटॉमी और सजावट के बाद वयस्क में कल्पना की गई थी, और चेहरे के मैंडिबुलर और मैक्सिलरी क्षेत्रों की उत्तेजना के बाद टीजी न्यूरॉन्स में जीसीएएमपी 6 के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की निगरानी की गई थी। हमने पुष्टि की कि प्रतिदीप्ति में वृद्धि परिधीय तंत्रिका ब्लॉक के साथ उत्तेजना-विकसित थी। हालांकि इस दृष्टिकोण के कई संभावित उपयोग हैं, हम इसका उपयोग परिधीय तंत्रिका चोट के बाद बदले गए टीजी न्यूरॉन्स के उप-जनसंख्या (ओं) को चिह्नित करने के लिए कर रहे हैं।
Introduction
सोमाटोसेंसेशन, मांसपेशियों, हड्डी और आंत सहित त्वचा या अन्य शारीरिक संरचनाओं पर यांत्रिक, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाओं की तंत्रिका एन्कोडिंग, प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स में गतिविधि से शुरू होती है जो इन संरचनाओं को संक्रमित करती हैं1. एकल इकाई आधारित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण ने इस प्रक्रिया में शामिल अभिवाही उपप्रकारों के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान किया है और साथ ही साथ उनके उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुण समय 1,2,3 के साथ कैसे बदल सकते हैं। हालांकि, जबकि लेबल लाइन सिद्धांत के समर्थन में मजबूत सबूत बने हुए हैं, जो बताता है कि विशिष्ट संवेदी तौर-तरीकों को न्यूरॉन्स के विशिष्ट उप-जनसंख्या (ओं) द्वारा व्यक्त किया जाता है, न्यूरॉन्स के कई उप-जनसंख्या की क्षमता एक ही प्रकार के यांत्रिक, थर्मल और रासायनिक उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए सुझाव देती है कि अधिकांश सोमैटोसेंसरी उत्तेजनाओं को न्यूरॉन्स4 के कई उप-जनसंख्या द्वारा एन्कोड किया गया है, 5. इस प्रकार, सोमैटोसेंसेशन की बेहतर समझ केवल 10 की गतिविधि का अध्ययन करने की क्षमता के साथ आएगी, यदि सैकड़ों नहीं, तो न्यूरॉन्स की।
कन्फोकल के अपेक्षाकृत हाल के आगमन के साथ ऑप्टिकल दृष्टिकोण में प्रगति और, बाद में, मल्टीफोटन और डिजिटल इमेजिंग तकनीकों ने न्यूरोनल गतिविधि 6,7 के अपेक्षाकृत गैर-इनवेसिव जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण करने की क्षमता की सुविधा प्रदान की है। इस तकनीक के अनुप्रयोग में अंतिम बाधाओं में से एक तंत्रिका गतिविधि के ऑप्टिकल मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए उपकरणों का विकास रहा है। एक ऐक्शन पोटेंशिअल की गति को देखते हुए जो एक मिलीसेकंड से भी कम समय में शुरू और समाप्त हो सकती है, एक ऐक्शन पोटेंशिअल की गति से झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का पालन करने की क्षमता वाला एक वोल्टेज-संवेदनशील डाई इस उद्देश्य के लिए आदर्श उपकरण होगा। लेकिन जबइस क्षेत्र 7,8,9,10 में जबरदस्त प्रगति हुई है, तो इनमें से कई रंगों के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात अभी भी एकल कोशिका स्तर पर सैकड़ों न्यूरॉन्स के जनसंख्या विश्लेषण को सक्षम करने के लिए काफी अधिक नहीं है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, जांचकर्ताओं ने इंट्रासेल्युलर सीए2 + एकाग्रता ([सीए2+] आई) में परिवर्तनों की निगरानी की है। इस रणनीति के साथ सीमाएं शुरू से ही स्पष्ट हैं और इस तथ्य को शामिल करती हैं कि [सीए2+] आई में वृद्धि तंत्रिका गतिविधि11 का एक अप्रत्यक्ष उपाय है; कि [सीए2+] में वृद्धि वोल्टेज-गेटेड सीए2+ चैनल (वीजीसीसी)12,13के सक्रियण से जुड़े सीए2+ प्रवाह से स्वतंत्र रूप से हो सकती है; कि सीए2+ क्षणिक की परिमाण और अवधि को वीजीसीसी गतिविधि 11,12,14 से स्वतंत्र प्रक्रियाओं द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है; और यह कि सीए2+ यात्रियों का समय-पाठ्यक्रम एक ऐक्शन पोटेंशिअल15 से कहीं अधिक है। फिर भी, तंत्रिका गतिविधि के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में सीए2 + के उपयोग से जुड़े कई महत्वपूर्ण फायदे हैं। इनमें से कम से कम अधिकांश सीए2+ संकेतकों से जुड़ा सिग्नल-टू-शोर अनुपात नहीं है, जो इंट्रासेल्युलर सीए2+ में परिवर्तन के परिमाण और इस तथ्य को दर्शाता है कि सिग्नल कोशिका झिल्ली के दो-आयामी स्थान के बजाय साइटोसोल के त्रि-आयामी स्थान से उत्पन्न हो रहा है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2+ संकेतक (जीईसीआई) के विकास के साथ, कोशिकाओं के विशिष्ट उप-जनसंख्या में सीए2+ संकेतकों की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए आनुवंशिक रणनीतियों का लाभ उठाना संभव है, जिससे बरकरार तैयारी में जनसंख्या-स्तर के विश्लेषण की सुविधा मिलती है (उदाहरण के लिए,16 देखें)।
चूहों में अब उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की संख्या को देखते हुए, इसमें कोई आश्चर्य नहीं होना चाहिए कि इस प्रजाति में जीईसीआई का सबसे बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। संवेदी न्यूरॉन्स की उप-जनसंख्या में संवैधानिक जीईसीआई अभिव्यक्ति के साथ माउस लाइनें 7,16,17 विकसित की गई हैं। विशिष्ट सेल प्रकारों में recombinases व्यक्त माउस लाइनों के विकास के साथ, यह GECI अभिव्यक्ति15 को नियंत्रित करने के लिए और भी अधिक परिष्कृत रणनीतियों का उपयोग करने के लिए संभव है. हालांकि, जबकि ये उपकरण कभी अधिक शक्तिशाली होते हैं, ऐसे कई कारण हैं कि अन्य प्रजातियां, जैसे चूहे, कुछ प्रयोगात्मक प्रश्नों के लिए अधिक उपयुक्त हो सकती हैं। इनमें बड़े आकार शामिल हैं, जो कई प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की सुविधा प्रदान करते हैं जो मुश्किल हैं, यदि असंभव नहीं है, तो छोटे माउस में; अपेक्षाकृत जटिल व्यवहार कार्यों में चूहों को प्रशिक्षित करने में आसानी; और कम से कम कुछ सबूत है कि बायोफिजिकल गुण और चूहे संवेदी न्यूरॉन्स में कई आयन चैनलों की अभिव्यक्ति पैटर्न मानव संवेदी न्यूरॉन्स में मनाया कि मानव18 के सापेक्ष माउस में एक ही चैनल हैं की तुलना में अधिक समान हो सकता है.
सोमैटोसेंसरी उत्तेजनाओं का पारगमन आम तौर पर प्राथमिक afferents के परिधीय टर्मिनलों में होता है, जबकि परिधि में शुरू कार्रवाई क्षमता प्राथमिक अभिवाही सोमाटा, पृष्ठीय जड़ (DRG) या trigeminal (टीजी) गैन्ग्लिया के रूप में संदर्भित संरचना के माध्यम से पारित करना चाहिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र19. जबकि इस बात के प्रमाण हैं कि प्राथमिक अभिवाही अक्षतंतु के साथ प्रचारित प्रत्येक क्रिया क्षमता कोशिका शरीर20 पर आक्रमण नहीं करेगी, इस तथ्य का एक परिणाम है कि प्राथमिक अभिवाही सोमता एक टी-जंक्शन19 के माध्यम से मुख्य अभिवाही अक्षतंतु से जुड़े हैं, परिधि में शुरू की गई अधिकांश क्रिया क्षमता सोम21 पर आक्रमण करती दिखाई देती है. प्राथमिक अभिवाही में जनसंख्या कोडिंग का आकलन करने के लिए जीईसीआई का उपयोग करते समय यह तीन प्रयोगात्मक लाभ प्रदान करता है: अक्षतंतु के सापेक्ष सेल बॉडी का बड़ा आकार अभिवाही गतिविधि के अप्रत्यक्ष उपाय के रूप में [सीए2+] i का उपयोग करते समय शोर के संकेत को और बढ़ाता है; डीआरजी आमतौर पर उपयोग करना आसान होता है; और अभिवाही टर्मिनलों से स्थानिक रूप से दूरस्थ साइट पर गतिविधि का आकलन अभिवाही टर्मिनलों के उत्तेजना-प्रतिक्रिया गुणों पर गैन्ग्लिया को उजागर करने के लिए आवश्यक सर्जरी के संभावित प्रभाव को कम करता है। हालांकि, क्योंकि टीजी मस्तिष्क के नीचे (या पैलेट के ऊपर) स्थित हैं, इसलिए वे डीआरजी की तुलना में उपयोग करना अधिक कठिन हैं। इसके अलावा, जबकि डीआरजी और टीजी न्यूरॉन्स के बीच कई समानताएं हैं, मतभेदों की बढ़ती सूची भी है। इसमें टीजी22 में न्यूरॉन्स के मोटे तौर पर सोमैटोटोपिक संगठन, अद्वितीय संरचनाएं, विभिन्न केंद्रीय टर्मिनल समाप्ति पैटर्न23,24,25,26, और अब जीन अभिव्यक्ति27,28 और कार्यात्मक रिसेप्टर अभिव्यक्ति29 दोनों में अंतर की बढ़ती सूची शामिल है. इसके अलावा, क्योंकि हम दर्द के परिधीय तंत्र की पहचान में रुचि रखते हैं, अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में दर्द सिंड्रोम जो ट्राइजेमिनल सिस्टम (जैसे, माइग्रेन, ट्राइजेमिनल न्यूराल्जिया, बर्निंग माउथ सिंड्रोम) के लिए अद्वितीय प्रतीत होते हैं जो प्राथमिक afferents30,31,32 में असामान्य गतिविधि को शामिल करते हैं, सुझाव देते हैं कि टीजी को सीधे अध्ययन करने की आवश्यकता है।
इस प्रकार, जबकि टीजी न्यूरॉन्स की उत्तेजना प्रतिक्रिया गुणों माउस16 में GECIs के साथ अध्ययन किया गया है, क्योंकि ऊपर सूचीबद्ध कारणों से पता चलता है कि चूहा प्रयोगात्मक सवालों की एक किस्म को संबोधित करने के लिए एक और अधिक उपयुक्त प्रजाति हो सकता है, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य चूहे में टीजी न्यूरॉन्स का अध्ययन करने के लिए GECIs का उपयोग करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित करने के लिए किया गया था. इसे प्राप्त करने के लिए, हमने परिधीय तंत्रिका तंत्र में GECI GCaMP6s की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक वायरल दृष्टिकोण का उपयोग किया। फिर हमने टीजी तक पहुंच की अनुमति देने के लिए अग्रमस्तिष्क को हटा दिया। अंत में, यांत्रिक और थर्मल उत्तेजनाओं को चेहरे पर लागू किया गया था, जबकि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के तहत न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन किया गया था। साथ में, ये डेटा कई राज्यों के तहत टीजी में परिवर्तनों की जांच करने के लिए चूहे का उपयोग करने के लिए एक भूमिका का समर्थन करते हैं, ट्राइजेमिनल सिस्टम में संवेदी कोडिंग में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं के लिए टूलकिट का विस्तार करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम टीजी इमेजिंग के लिए जीईसीआई चूहा पैदा करने का एक त्वरित, गैर-आक्रामक तरीका प्रदर्शित करते हैं। हमने जीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को चलाने और बनाए रखने के लिए एक सीएजी प्रमोटर चुना। जबकि पिछले अध…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कैथी अल्बर्स और ब्रायन डेविस को उनके लीका माइक्रोस्कोप और मेटामॉर्फ प्रोग्राम के उपयोग के लिए, चार्ल्स वारविक को हमारे थर्मल पेल्टियर डिवाइस के निर्माण में मदद करने के लिए, और सर्जिकल तैयारी के समस्या निवारण में मदद करने के लिए डॉ रेमंड सेकुला का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG), और R01NS122784 (MSG और RS)।
Materials
| AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 | Addgene | 100844-AAV9 | AAV9-GCaMP6s virus |
| ACEpromazine maleate | Covetrus | 11695-0095-5 | 10 mg/mL |
| AnaSed (Xylazine) injection | AKORN Animal Health | 23076-35-9 | 20 mg/mL |
| CTR5500 Electronics box | Leica | 11 888 820 | Power Supply |
| Cutwell burr drill bit | Ransom & Randolph | ¼ round | |
| DM 6000 FS | Leica | 11 888 928 | Base Stand |
| EL6000 | Leica | EL6000 | Light source with 120 W mercury bulb |
| Forceps | FST | 11252-00 | Dumont No. 05 |
| Friedman rongeurs | FST | 16000-14 | 2.5 mm cup size |
| Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16021-14 | 1 mm cup size |
| Heating pad (Temperature therapy pad) | STRYKER | 8002-062-022 | |
| Ketamine hydrochloride | Covetrus | 1695-0703-1 | 100 mg/mL |
| Plan Fluor 20x/0.40 | Leica | MRH00105 | 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD |
| Power handle high-temp cautery pen | Bovie | HIT1 | handheld Change-A-Tip cautery pen |
| Prime 95B | Photometrics | Prime 95B | CMOS Camera |
| Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | 0.9% Sterile Saline |
| Scalpel blade | Fisher Scientific | 22-079-701 | size 15 disposable blade |
| Spatula | BRI | 48-1460 | brain spatula |
| Spring scissors | FST | 91500-09 | Student Vannas, 5 mm cutting edge |
| Spring scissors | FST | 15012-12 | Noyes, 14 mm cutting edge |
| STP6000 Smart touch panel | Leica | 11 501 255 | Control Panel |
| Syringe | Hamilton | 80201 | 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe |
| Water heater | Adroit | HTP-1500 |
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