Analisi qualitativa e quantitativa della produzione di siderofori da Pseudomonas aeruginosa
Summary
Questo protocollo fornisce analisi sia qualitative che quantitative dei siderofori totali, della pioverdina e della piochelina di Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è noto per la sua produzione di una vasta gamma di fattori di virulenza per stabilire infezioni nell’ospite. Uno di questi meccanismi è l’eliminazione del ferro attraverso la produzione di siderofori. P. aeruginosa produce due diversi siderofori: la piochelina, che ha una minore affinità ferrochelante, e la pioverdina, che ha una maggiore affinità ferro-chelante. Questo rapporto dimostra che la pioverdina può essere quantificata direttamente dai surnatanti batterici, mentre la piochelina deve essere estratta dai surnatanti prima della quantificazione.
Il metodo principale per analizzare qualitativamente la produzione di siderofori è il test su piastra di agar con cromo azurolo solfonato (CAS). In questo saggio, il rilascio di colorante CAS dal complesso Fe3+-Dye porta a un cambiamento di colore dal blu all’arancione, indicando la produzione di siderofori. Per la quantificazione dei siderofori totali, i surnatanti batterici sono stati miscelati in proporzioni uguali con il colorante CAS in una piastra per microtitolazione, seguita da un’analisi spettrofotometrica a 630 nm. La pioverdina è stata quantificata direttamente dal surnatante batterico miscelandolo in proporzioni uguali con 50 mM Tris-HCl, seguita da analisi spettrofotometrica. Un picco a 380 nm ha confermato la presenza di pioverdina. Per quanto riguarda la piochelina, non è stato possibile quantificarla direttamente dal surnatante batterico, quindi è stato necessario estrarla prima. Successive analisi spettrofotometriche hanno rivelato la presenza di piochelina, con un picco a 313 nm.
Introduction
Gli organismi hanno bisogno di ferro per svolgere varie funzioni vitali, come il trasporto di elettroni e la replicazione del DNA1. Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunista Gram-negativo, è noto per possedere una varietà di fattori di virulenza per stabilire l’infezione nell’ospite, tra cui un meccanismo è la formazione di siderofori2. Durante le condizioni di esaurimento del ferro, P. aeruginosa rilascia molecole specializzate chiamate siderofori, che estinguono il ferro dall’ambiente circostante. I siderofori chelano il ferro extracellulare e il complesso ferrico-sideroforo risultante viene attivamente trasportato nella cellula3.
P. aeruginosa è nota per produrre due siderofori, la pioverdina e la piochelina. La pioverdina è nota per avere una maggiore affinità chelante del ferro (1:1), mentre la piochelina è nota per avere una minore affinità chelante del ferro (2:1)4. La piochelina è anche chiamata sideroforo secondario perché ha una minore affinità chelante del ferro5. La produzione e la regolazione dei siderofori sono attivamente controllate da sistemi di Quorum Sensing (QS) in P. aeruginosa6.
Oltre alla tempra del ferro, i siderofori sono anche coinvolti nella regolazione dei fattori di virulenza e svolgono un ruolo attivo nella formazione del biofilm7. I siderofori svolgono ulteriori ruoli cruciali, tra cui il coinvolgimento nella segnalazione cellulare, la difesa contro lo stress ossidativo e la facilitazione delle interazioni tra le comunità microbiche8. I siderofori sono tipicamente classificati in base ai gruppi funzionali specifici attraverso i quali chelano il ferro. I tre ligandi bidentati primari in questa classificazione sono il catecolato, l’idrossiammato e il α-idrossicarbossilato3. Le pioverdine sono segni distintivi delle specie fluorescenti di Pseudomonas come P. aeruginosa e P. fluorescens5. Sono costituiti da un cromoforo fluorescente verde misto accoppiato ad un oligopeptide contenente 6-12 amminoacidi. Diverse peptidi sintetasi non ribosomiali (NRP) sono coinvolte nella loro sintesi9. Quattro geni coinvolti nella produzione e nella regolazione della pioverdina sono pvdL, pvdI, pvdJ e pvdD10. La pioverdina è anche responsabile dell’infezione e della virulenza nei mammiferi11. È noto che P. aeruginosa produce piochelina in condizioni moderatamente limitanti il ferro, mentre la pioverdina viene prodotta in ambienti severi che limitano il ferro12. Due operoni coinvolti nella produzione di piochelina sono pchDCBA e pchEFGHI13. Si noti che in presenza di piocianina, la piochelina (catecolato) induce danno ossidativo e infiammazione e genera radicali ossidrilici, dannosi per i tessuti dell’ospite11.
Il test del cromo azurolo solfonato (CAS) è ampiamente adottato grazie alla sua completezza, all’elevata sensibilità e alla maggiore praticità rispetto ai saggi microbiologici che, sebbene sensibili, possono essere eccessivamente specifici14. Il test CAS può essere condotto su superfici di agar o in soluzione. Si basa sul cambiamento di colore che si verifica quando lo ione ferrico passa dal suo complesso blu intenso all’arancione. Il test colorimetrico CAS quantifica l’esaurimento del ferro da un complesso ternario Fe-CAS-tensioattivo. Questo particolare complesso, costituito da metallo, colorante organico e tensioattivo, ha un colore blu e presenta un picco di assorbimento a 630 nm.
Questo rapporto presenta un metodo per la rilevazione qualitativa della produzione di siderofori, in cui è possibile rilevare la produzione di siderofori su una piastra di agar. Viene inoltre fornito un metodo per la stima quantitativa della produzione totale di siderofori in una piastra per microtitolazione e la rilevazione e l’analisi quantitativa di due siderofori, pioverdina e piochelina, da P. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare i siderofori totali e due diversi siderofori di P. aeruginosa, vale a dire la pioverdina e la piochelina, dal surnatante batterico privo di cellule. Nel saggio su piastre di agar CAS, il colorante CAS e gli ioni Fe3+ formano un complesso. Quando i batteri producono siderofori, estinguono gli ioni Fe3+ dal complesso CAS-Fe3+, portando a un cambiamento di colore intorno alla crescita batterica. Questo cambiamento si traduce …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il finanziamento da parte di DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program e FIST. MR ringrazia la borsa di studio ricevuta da SHODH. HP ringrazia la borsa di studio ricevuta dal CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
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