Kvalitativ och kvantitativ analys av sideroforproduktion från Pseudomonas aeruginosa
Summary
Detta protokoll ger både kvalitativa och kvantitativa analyser av totala sideroforer, pyoverdin och pyochelin från Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) är känd för sin produktion av ett brett spektrum av virulensfaktorer för att etablera infektioner i värden. En sådan mekanism är rensning av järn genom sideroforproduktion. P. aeruginosa producerar två olika sideroforer: pyochelin, som har lägre järnkelaterande affinitet, och pyoverdin, som har högre järnkelaterande affinitet. Denna rapport visar att pyoverdin kan kvantifieras direkt från bakteriella supernatanter, medan pyochelin måste extraheras från supernatanter före kvantifiering.
Den primära metoden för kvalitativ analys av sideroforproduktion är agarplattanalysen med kromazurolsulfonat (CAS). I denna analys leder frisättningen av CAS-färgämne från Fe3+-Dye-komplexet till en färgförändring från blått till orange, vilket indikerar sideroforproduktion. För kvantifiering av totala sideroforer blandades bakteriella supernatanter i lika stora proportioner med CAS-färgämne i en mikrotiterplatta, följt av spektrofotometrisk analys vid 630 nm. Pyoverdin kvantifierades direkt från den bakteriella supernatanten genom att blanda den i lika stora proportioner med 50 mM Tris-HCl, följt av spektrofotometrisk analys. En topp vid 380 nm bekräftade förekomsten av pyoverdin. När det gäller pyokelin var det inte möjligt att direkt kvantifiera det från den bakteriella supernatanten, så det måste extraheras först. Efterföljande spektrofotometrisk analys avslöjade närvaron av pyochelin, med en topp vid 313 nm.
Introduction
Organismer behöver järn för att utföra olika vitala funktioner, såsom elektrontransport och DNA-replikation1. Pseudomonas aeruginosa, en gramnegativ opportunistisk patogen, är känd för att ha en mängd olika virulensfaktorer för att etablera infektion i värden, bland vilka en mekanism är sideroforbildning2. Under järnutarmande förhållanden frigör P. aeruginosa specialiserade molekyler som kallas sideroforer, som släcker järn från den omgivande miljön. Sideroforer kelerar järn extracellulärt, och det resulterande järn-sideroforkomplexet transporteras aktivt tillbaka till cell3.
P. aeruginosa är känd för att producera två sideroforer, pyoverdin och pyochelin. Pyoverdin är känt för att ha en högre järnkelaterande affinitet (1:1), medan pyochelin är känt för att ha en mindre järnkelaterande affinitet (2:1)4. Pyochelin kallas också en sekundär siderofore eftersom den har en lägre järnkelaterande affinitet5. Produktionen och regleringen av sideroforer styrs aktivt av kvorumavkänningssystem (QS) i P. aeruginosa6.
Förutom järnsläckning är sideroforer också involverade i regleringen av virulensfaktorer och spelar en aktiv roll i biofilmbildning7. Sideroforer har ytterligare viktiga roller, inklusive involvering i cellsignalering, försvar mot oxidativ stress och underlättande av interaktioner mellan mikrobiella samhällen8. Sideroforer kategoriseras vanligtvis baserat på de specifika funktionella grupper genom vilka de kelerar järn. De tre primära bidentatliganderna i denna klassificering är katekolat, hydroxamat och α-hydroxikarboxylat3. Pyoverdiner är kännetecken för fluorescerande Pseudomonas-arter som P. aeruginosa och P. fluorescens5. De består av en blandad grön fluorescerande kromofor kopplad till en oligopeptid innehållande 6-12 aminosyror. Flera icke-ribosomala peptidsyntetaser (NRP) är involverade i deras syntes9. Fyra gener som är involverade i pyoverdinproduktion och reglering är pvdL, pvdI, pvdJ och pvdD10. Pyoverdin är också ansvarig för infektion och virulens hos däggdjur11. P. aeruginosa har noterats producera pyochelin under måttliga järnbegränsande förhållanden, medan pyoverdin produceras under svåra järnbegränsande miljöer12. Två operoner som är involverade i pyochelinproduktion är pchDCBA och pchEFGHI13. Det noteras att i närvaro av pyocyanin inducerar pyochelin (katekolat) oxidativ skada och inflammation och genererar hydroxylradikaler, som är skadliga för värdvävnader11.
Analysen av kromazurolsulfonat (CAS) används i stor utsträckning på grund av dess omfattning, höga känslighet och större bekvämlighet jämfört med mikrobiologiska analyser, som, även om de är känsliga, kan vara alltför specifika14. CAS-analysen kan utföras på agarytor eller i en lösning. Den förlitar sig på den färgförändring som uppstår när järnjonen övergår från sitt intensiva blå komplex till orange. CAS-kolorimetrisk analys kvantifierar utarmningen av järn från ett Fe-CAS-ytaktivt ternära komplex. Detta speciella komplex, som består av metall, organiskt färgämne och ytaktivt ämne, har en blå färg och uppvisar en absorptionstopp vid 630 nm.
Denna rapport presenterar en metod för kvalitativ detektion av sideroforproduktion, där man kan detektera produktionen av sideroforer på en agarplatta. En metod för kvantitativ uppskattning av den totala sideroforproduktionen i en mikrotiterplatta och detektion och kvantitativ analys av två sideroforer, pyoverdin och pyochelin, från P. aeruginosa, tillhandahålls också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt för forskare att kvantifiera totala sideroforer och två olika sideroforer av P. aeruginosa, nämligen pyoverdin och pyochelin, från den bakteriecellfria supernatanten. I analysen av CAS-agarplattorna bildar CAS-färgämne och Fe3+-joner ett komplex. När bakterier producerar sideroforer släcker de Fe3+-joner från CAS-Fe3+-komplexet, vilket leder till en färgförändring runt bakterietillväxten. Denna förändring resulterar i en tydlig ora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner finansiering från DBT – Biotechnology Teaching Program, DBT – BUILDER Program och FIST. MR tackstipendium mottaget från SHODH. HP tackar stipendium mottaget från CSIR.
Materials
| Agar Agar, Type I | HIMEDIA | GRM666 | |
| 8-Hydroxyquinoline | Loba Chemie | 4151 | |
| Casamino Acid | SRL Chemicals | 68806 | |
| Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB) | HIMEDIA | RM4867-100G | |
| Chloroform | Merck | 1070242521 | |
| Chrome azurol sulfonate | HIMEDIA | RM336-10G | |
| Citric acid | Merck | 100241 | |
| Dextrose monohydrate | Merck | 108342 | |
| Dichloromethane | Merck | 107020 | |
| Ferric chloride hexahydrate | HIMEDIA | GRM6353 | |
| Glass Flasks | Borosil | 5100021 | |
| Glass Test-tubes | Borosil | 9820U05 | |
| Hydrochloric acid | SDFCL | 20125 | |
| King's medium B base | HIMEDIA | M1544-500G | |
| M9 Minimal Medium Salts | HIMEDIA | G013-500G | |
| Magnesium Sulphate | Qualigens | 10034 | |
| MultiskanGO UV Spectrophotometer | Thermo Scientific | 51119200 | |
| Peptone Type I, Bacteriological | HIMEDIA | RM667-500G | |
| PIPES free acid | MP Biomedicals | 190257 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1048731000 | |
| Proteose peptone | HIMEDIA | RM005-500G | |
| Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer | Shimadzu | 2072310058 | |
| Sigma Laborzentrifuge | Sigma-Aldrich | 3-18K | |
| Sodium chloride | Qualigens | 15915 |
References
- Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
- Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
- Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711 (2022).
- Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
- Cornelis, P., Dingemans, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
- Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
- Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
- Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
- Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
- Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
- Geum-Jae-Jeong, , et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
- Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).
- Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
- Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
- Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
- Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
- Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
- Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
- Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
- Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
- Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
- Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
- Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135 (2019).
- Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
- Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
- Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).
