שיטת שימור ארוכת טווח לזני דרוזופילה כחלופה להעברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון טריים רצויה מאוד. פרוטוקול זה מתאר שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים של דרוזופילה והחייאת זנים באמצעות השתלתם בעוברים מארחים אגמטיים.
זני דרוזופילה חייבים להישמר על ידי העברה תכופה של זבובים בוגרים לבקבוקונים חדשים. זה טומן בחובו סכנה של הידרדרות מוטציות ושינויים פנוטיפיים. לכן פיתוח שיטה חלופית לשימור ארוך טווח ללא שינויים כאלה הוא הכרחי. למרות ניסיונות מוצלחים קודמים, שימור בהקפאה של עוברי דרוזופילה עדיין אינו שימושי מבחינה מעשית בגלל יכולת שחזור נמוכה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לשימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) ולהחייאת זנים באמצעות השתלת PGCs משומרים בהקפאה בעוברים מארחים אגמטיים מסוג Drosophila melanogaster (D. melanogaster). PGCs חדירים מאוד לחומרים מגנים על הקפאה (CPAs), ושונות התפתחותית ומורפולוגית בין זנים היא פחות בעייתית מאשר בשימור בהקפאה של עוברים. בשיטה זו, PGCs נאספים מכ -30 עוברים תורמים, מועמסים לתוך מחט לאחר טיפול CPA, ולאחר מכן נשמרים בהקפאה בחנקן נוזלי. כדי לייצר גמטות שמקורן בתורם, ה-PGCs השמורים בהקפאה במחט מופשרים ולאחר מכן מופקדים בכ-15 עוברים מארחים אגמטיים. בפרוטוקול זה הושגה תדירות של לפחות 15% זבובים פוריים, ומספר הצאצאים לכל זוג פורה היה תמיד די והותר כדי להחיות את הזן המקורי (מספר הצאצאים הממוצע היה 77.2 ± 7.1), מה שמצביע על יכולתם של PGCs שמורים בהקפאה להפוך לתאי גזע של תאי גזע. המספר הממוצע של זבובים פוריים למחט היה 1.1 ±-0.2, ו-9 מתוך 26 מחטים הניבו שני צאצאים פוריים או יותר. נמצא כי 11 מחטים מספיקות כדי לייצר 6 צאצאים או יותר, שבהם נכללים ככל הנראה לפחות נקבה אחת וזכר אחד. הפונדקאי האגמטי מאפשר להחיות את הזן במהירות פשוט על ידי חציית זבובים נקביים וזכרים שזה עתה הופיעו. בנוסף, ל-PGCs יש פוטנציאל לשמש ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום.
תחזוקת זני דרוזופילה על ידי העברת זבובים בוגרים לבקבוקוני מזון חדשים גורמת בהכרח להצטברות מוטציות ושינויים אפיגנטיים לאורך זמן. פיתוח שיטה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה ללא שינויים כאלה הוא הכרחי, במיוחד עבור זני ייחוס שבהם יש לשמור על כל הגנום. מספר ניסיונות מוצלחים לשמר בהקפאה עוברים או שחלות דרוזופילה תוארו 1,2,3. למרבה הצער, הם עדיין לא בשימוש מעשי בגלל יכולת שחזור נמוכה. ואכן, לעוברים בשלב מוקדם יש שיעור הישרדות נמוך לאחר שימור בהקפאה בגלל תכולת החלמון הגבוהה שלהם, המעכבת חדירה ודיפוזיה של חומר מגן קריוגני (CPA) 2,3. חדירות CPA מוגבלת מאוד גם על ידי שכבות השעווה של עוברים בשלב מאוחר. קשה וגוזל זמן למצוא פרק זמן ספציפי שבו לעוברים יש שיעור הישרדות גבוה ושכבת שעווה דקה יותר. לאחרונה, Zhan et al.4 שיפרו שיטות לחדירת עוברים, העמסת CPA וויטריפיקציה והצליחו להקפיא עוברים מזנים מרובים. עם זאת, השיטות אינן קלות ליישום מכיוון שהכדאיות של עוברים לאחר חדירה נוטה להיות גרועה. לכן, שיפור נוסף ופיתוח של גישות חלופיות עדיין נדרשים. שיטות הכוללות שימור בהקפאה של תאי נבט קדמוניים (PGC) הן גישה חלופית לתחזוקה ארוכת טווח של זני דרוזופילה.
השתלת PGC (המכונה גם תאי קוטב) שימשה ליצירת כימרות נבט, במיוחד נקבות, כדי לחקור תהליכים כגון השפעות אימהיות של מוטציות קטלניות זיגוטיות וקביעת מין של תאי נבט 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGCs הם הרבה יותר קטנים מאשר עוברים והם צפויים להיות חדירים מאוד עבור רוב cryoprotectants. יתר על כן, השונות ההתפתחותית והמורפולוגית בין הזנים בעייתית פחות, ופונדקאי אגמטי מאפשר שחזור מהיר של גנומים שלמים. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשימור קריוגניPGC 13, המונעת את השינויים הגנטיים והאפיגנטיים הבלתי נמנעים בזני דרוזופילה. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המפורט.
שיטת שימור קריוגנית זו דורשת מומחיות ספציפית בטיפול ובמכשור PGC. בעוד שגישה שלב אחר שלב עשויה להיות פתרון יעיל עבור אלה שאינם מכירים אותה, היא עשויה להיות לא מתאימה למעבדות קטנות בשל דרישות המכשור. פרוטוקול PGC זה לשימור קריוגני יכול להיות מותאם בקלות רבה יותר לשימוש עם מיני דרוזופילה שונים ומיני חרקים שונים מאשר פרוטוקולי שימור הקפאה של עוברים בגלל הבדלים התפתחותיים ומורפולוגיים קטנים יותר. PGCs יכולים לשמש גם ביישומי הנדסה גנטית, כגון עריכת גנום 14,15,16. לסיכום, ניתן להשתמש בשיטה זו במרכזי מלאי ובמעבדות אחרות כדי לשמור על זני זבובים וזני חרקים אחרים לפרקי זמן ממושכים ללא שינויים.
גורם קריטי להצלחה בשימור הקפאה והחייאת PGC הוא שימוש בעוברים טובים. יש להשתמש בנקבות צעירות (למשל, בנות 3 עד 5 ימים) לאיסוף עוברים. הן העובר התורם והן העובר המארח מוערכים על ידי בדיקה מיקרוסקופית, ורק אלה בשלב הבלסטודרם (שלב 5) משמשים12. עבור איסוף PGC, אנו בדרך כלל מיישרים כ -40 עוברים ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למרכז המניות KYOTO Drosophila על זני הזבובים. אנו מודים גם לגב’ וונדה מיאטה על עריכת כתב היד בשפה האנגלית ולד”ר ג’רמי אלן מאדנז (https://jp.edanz.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146) מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) ל- T.T.-S.-K., מענקים (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145) מ- AMED ל- S.K., מענק (JP20km0210172) מ- AMED ל- T.T.-S.-K. ו-S.K., מענק סיוע למחקר מדעי (C) (JP19K06780) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) ל-T.T.-S.-K., ומענק סיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (JP18H05552) מ-JSPS ל-S.K.
Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |