Her presenterer vi et assembloidmodellsystem for å etterligne senecellulær crosstalk mellom det bærende senekjernevevet og et ekstrinsisk rom som inneholder cellepopulasjoner aktivert av sykdom og skade. Som et viktig brukstilfelle demonstrerer vi hvordan systemet kan distribueres for å undersøke sykdomsrelevant aktivering av ytre endotelceller.
Sener muliggjør bevegelse ved å overføre muskelkrefter til bein. De er avhengige av en tøff senekjerne som består av kollagenfibre og stromale cellepopulasjoner. Denne bærende kjernen er omfattet, næret og reparert av et synoviallignende vevslag som består av det ytre senekammeret. Til tross for denne sofistikerte designen er seneskader vanlige, og klinisk behandling er fortsatt avhengig av fysioterapi og kirurgi. Begrensningene i tilgjengelige eksperimentelle modellsystemer har bremset utviklingen av nye sykdomsmodifiserende behandlinger og tilbakefallsforebyggende kliniske regimer.
In vivo studier på mennesker er begrenset til å sammenligne friske sener med sykdomst eller sprukket vev i sluttstadiet som ble tatt prøver under reparasjonskirurgi, og tillater ikke longitudinell studie av den underliggende senesykdommen. In vivo dyremodeller presenterer også viktige grenser med hensyn til ugjennomsiktig fysiologisk kompleksitet, den etiske byrden for dyrene og store økonomiske kostnader forbundet med bruken av dem. Videre er in vivo dyremodeller dårlig egnet til systematisk undersøkelse av legemidler og flercellede interaksjonsveier for flere vev. Enklere in vitro-modellsystemer har også kommet til kort. En viktig årsak er en manglende evne til å tilstrekkelig replikere den tredimensjonale mekaniske belastningen som er nødvendig for å meningsfylt studere seneceller og deres funksjon.
Det nye 3D-modellsystemet som presenteres her, lindrer noen av disse problemene ved å utnytte murine tail tendon core explants. Det er viktig at disse eksplantene er lett tilgjengelige i stort antall fra en enkelt mus, beholder 3D in situ-lastemønstre på mobilnivå, og har en in vivo-lignende ekstracellulær matrise. I denne protokollen gis trinnvise instruksjoner om hvordan man forsterker senekjerneplanter med kollagenhydrogeler lastet med muskelavledede endotelceller, seneavledede fibroblaster og benmargsavledede makrofager for å erstatte sykdoms- og skadeaktiverte cellepopulasjoner i det ytre senekammeret. Det er demonstrert hvordan de resulterende seneassembloidene kan utfordres mekanisk eller gjennom definerte mikromiljøstimuli for å undersøke nye flercellede crosstalk under sykdom og skade.
I sin funksjon av å overføre muskelkrefter til beinene for å muliggjøre bevegelse, står sener overfor noen av de mest ekstreme mekaniske påkjenningene som forekommer i menneskekroppen 1,2,3. På grunn av aldrende samfunn, økende fedmeutbredelse og den økende populariteten til mekanisk krevende sportsaktiviteter, forventes forekomsten av senesykdommer og skader å klatre i utviklede land 4,5,6. Utviklingen av nye evidensbaserte og sykdomsmodifiserende behandlingsregimer for å bekjempe denne økningen har blitt hindret av begrensninger i dagens tilgjengelige modellsystemer 1,7,8.
Ideelt sett ville sykdoms- og skadereparasjonsmodeller tillate å studere hvordan målorganet behandler et definert sett med inngangsparametere (imiterende sykdomsutløsere, tabell 1) til målbare utgangsparametere (som representerer sykdomskjennetegn, tabell 2) mens man kontrollerer for konfunderende faktorer. Studier ved hjelp av slike modellsystemer vil da kunne identifisere de (pato-) fysiologiske prosessene som ligger til grunn for reparasjon av sykdom og skade og få kunnskap som kan utnyttes til å forebygge eller redusere sykdoms- og skadekjennetegn i klinikkene. Ved å anvende dette prinsippet på sener, bør et nyttig modellsystem rekapitulere sentrale deler av in vivo seneresponsen på sykdom og skade, som omfatter følgende kjennetegn: mikroskader, betennelse, neovaskularisering, hypercellularitet, akselerert matriksomsetning og dekompartmentalisering 9,10,11,12,13,14,15 . Ved å bruke disse kjennetegnene som base, kan følgende krav til et vellykket senesykdom og skadereparasjonsmodellsystem utledes.
Mekanisk overbelastning antas å være en sentral faktor ved seneskade og sykdomspatogenese og er dermed en mye brukt eksperimentell tilnærming for å skape mikroskader16. Kontrollerbar mekanisk lastbarhet er derfor en viktig forutsetning for senesykdom og skadereparasjonsmodeller. Ideelt sett muliggjør modellsystemet tre hovedmoduser: enkel belastning fra strekk til skade, utmattingsbelastning og lossing 8,17,18. Ved mekanisk deformasjon opplever vev-residente celler en kompleks kombinasjon av spenningskrefter, skjærkrefter (på grunn av glidning av kollagenfibre som omgir cellene) og kompresjonskrefter som oppstår under lossing eller nær enthesis19,20. Modellsystemer bør gjenskape disse komplekse lastemønstrene så nært som mulig.
En alternativ måte å introdusere matriksmikroskade på er å utnytte biokjemiske stressorer som etterligner systemiske predisposisjoner for senesykdom og skade, for eksempel (pro-) inflammatoriske cytokiner, oksidativt stress eller høye glukosekonsentrasjoner 21,22,23. Følgelig er et kontrollerbart nisjemikromiljø fordelaktig for et senesykdom og skadereparasjonsmodellsystem.
En vanlig forutsetning for at modellsystemer skal kunne rekapitulere betennelse, neovaskularisering og hypercellularitet er den selektive tilstedeværelsen av cellepopulasjoner som driver disse prosessene24. For inflammatoriske prosesser inkluderer disse populasjonene nøytrofiler, T-celler og makrofager, mens endotelceller og pericytter ville være nødvendig for å studere neovaskularisering 25,26,27,28,29. Senefibroblaster er ikke bare avgjørende for senereparasjon, men som proliferative og migrerende celler, også delvis ansvarlig for den lokale hypercellulariteten observert i senesykdom 30,31,32,33,34,35,36.
I tillegg til endringer i residente cellepopulasjoner, endres senematrisesammensetningen ved senesykdom og skade samt 7,37,38,39,40. For å presentere de riktige sykdomsrelevante mikromiljøsignalene, bør modellsystemer kunne integrere en ekstracellulær matrikssammensetning tilpasset det målrettede sykdoms- eller skadestadiet, for eksempel ved å muliggjøre relevante proporsjonale kombinasjoner av kollagen-1, kollagen-3 og cellulært fibronektin41.
Oppdelingen av friske sener i senekjernen og de ytre rommene (dvs. endotenon, epitenon og paratenon) er sentral for deres funksjon og ofte forstyrret i syke eller skadede sener 1,42,43,44,45,46,47 . Inkorporering av 3D-seneoppdeling i senemodellsystemer er derfor ikke bare nødvendig for å simulere prosessene som ligger til grunn for de- og re-compartmentalization nærmere, men bidrar også til å etablere de riktige spatiotemporale gradientene av cytokiner og næringsstoffer48,49.
Endelig er modularitet en annen sentral ressurs for modellsystemer, slik at forskere kan kombinere det riktige relative bidraget til og samspillet mellom de tidligere beskrevne stressorene under de undersøkte prosessene 8,17.
I tillegg til å velge de optimale inngangsmodalitetene, er et viktig trinn å kunne måle, observere og spore endringer i den resulterende utgangen. De mekaniske egenskapene til modellsystemet (dvs. tåområdelengde, lineær elastisk modul, maksimal strekkbelastning, maksimal strekkbelastning, utmattingsstyrke og stressavslapping) er sentrale her, da de karakteriserer senens hovedfunksjon 50,51,52. For å knytte disse funksjonelle endringene til endringer på vevsnivå, er det viktig å muliggjøre metoder for å oppdage (kollagen) strukturelle matriksskader og spore spredning og rekruttering av sykdoms- og reparasjonsrelevante cellepopulasjoner 30,53,54,55,56,57,58,59,60.
For å studere nye cellecelle- og cellematrisekrysstal, bør man være i stand til å isolere eller merke proteiner i tilstrekkelige mengder for kvantifisering (dvs. ELISA, proteomikk, immunhistokjemi, flowcytometri)14,21,61,62. Populasjons- eller i det minste romspesifikk genuttrykksanalyse bør også være mulig (dvs. fluorescensaktivert cellesortering [FACS], enkeltcelle / bulk RNA-sekvensering og sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR))21,24,27,63. Modellsystemet skal tillate måling av så mange av de nevnte utgangsparametrene på samme prøve og på flere eksemplarer på en måte som er rask nok til å låse opp studier med høy gjennomstrømning.
Blant modellsystemer som for tiden er tilgjengelige for å studere menneskelig senesykdom og skadereparasjon, er menneskekroppen selv selvfølgelig den mest representative. Det er også minst kompatibelt med eksperimentell intervensjon. Mens pasienter med akutte seneskader er rikelig tilgjengelige for kliniske studier, er pasienter med tidlig tendinopati (den vanligste senesykdommen) stort sett symptomfrie og går ofte klinisk uoppdaget til mer alvorlige endringer manifesterer 14,64,65. Dette gjør det vanskelig å fastslå det kritiske øyeblikket når senehomeostasen sporer av og mekanismene bak denne avsporingen 16,66,67,68,69. I tillegg er uttak av biopsier fra friske sener etisk utfordrende, da det kan føre til vedvarende skade. Hamstring senerester fra fremre korsbånd rekonstruksjon kirurgi brukes ofte som friske kontroller, men uten tvil forskjellig i funksjon, mekaniske egenskaper, cellepopulasjoner og matrikssammensetning sammenlignet med rotator mansjett, akilles, og patellar sener ofte påvirket av senesykdom og skade 70,71,72,73.
In vivo dyremodeller er mer tilgjengelige og håndterbare, men bruken av dem påfører dyrene en betydelig etisk byrde og økonomiske kostnader for forskerne. I tillegg utvikler de fleste av de populære modelldyrene enten ikke tendinopatiske lesjoner spontant (dvs. rotter, mus, kaniner) eller mangler primere og genetisk modifiserte stammer som er nødvendige for å spore de multicellulære kommunikasjonsveiene som er involvert i det (dvs. hester, kaniner).
Enkle 2D in vitro-modellsystemer er på den andre siden av kompleksitets- / trekkbarhetsspekteret og tillater bedre kontrollert, tidseffektiv studie av spesifikke intercellulære kommunikasjonsveier som svar på et mer kontrollerbart sett med utløsere 8,74. Imidlertid klarer disse forenklede systemene ofte ikke å rekapitulere den flerdimensjonale mekaniske belastningen (dvs. spenning, kompresjon og skjær) som er sentral for senefunksjonalitet. I tillegg har de (for) høye stivhetene i vevskulturplast en tendens til å overstyre eventuelle matrikssignaler fra belegg som er ment å etterligne sykdomstilstandenav interesse 75,76.
For å overvinne denne ulempen har stadig mer sofistikerte vevskonstruerte 3D-modellsystemer blitt utviklet for å gi en lastbar matrise hvis sammensetning i det minste delvis kan tilpasses den ønskede sykdomstilstanden 77,78,79. Likevel sliter disse systemene ikke bare med å nøyaktig replikere komplekset in vivo ekstracellulære matrisesammensetninger og cellulære belastningsmønstre, men mangler generelt langsiktig lastbarhet og de kompartmentale grensesnittene som kreves for å studere de tverrkompartmentale kommunikasjonsveiene som koordinerer senesykdom og skadereparasjon 48,49,80.
Ex vivo seneeksplantasjonsmodellsystemer har den klare fordelen av en innebygd in vivo-lignende matrisesammensetning som består av pericellulære nisjer, tverrkompartmentale barrierer, samt spatiotemporal cytokin / næringsgradienter og rekapitulerer komplekse lastemønstre når de strekkes8. Som et resultat av størrelsesavhengige næringsdiffusjonsgrenser er eksplanter fra større dyremodeller (dvs. hester) vanskelige å holde i live for den langsiktige studien av senesykdom og skadereparasjon 81,82,83. I mellomtiden er mindre eksplanter fra murinarter (dvs. akillessenen, patellarsenen) utfordrende å reproduserbart klemme og mekanisk laste. Størrelsen begrenser også mengden materiale som kan samles inn for celle-, protein- og gennivåavlesninger uten å samle prøver og redusere gjennomstrømningen. I denne forstand gir murine halesenefascikler potensialet til å låse opp høy gjennomstrømningsstudie av senesykdom og skadereparasjon, da de er lett tilgjengelige i store mengder fra en enkelt mus, bevare komplekset in vivo pericellulær matrikssammensetning og rekapitulere cellulære belastningsmønstre. Under ekstraksjonsprosessen mister de imidlertid det meste av sitt ytre rom, og det inneholdt vaskulære, immun- og fibroblastpopulasjoner som nå anses å drive senesykdom og reparasjon 8,18.
For å bygge bro over dette gapet er det utviklet et modellsystem som kombinerer fordelene med murine halesene-avledede kjerneplanter med fordelene med 3D hydrogelbaserte modellsystemer. Dette modellsystemet består av en cellebelastet (kollagen-1) hydrogel støpt rundt haleseneexplants 84,85. I dette papiret er de nødvendige produksjonstrinnene gitt i detalj sammen med nyttige avlesninger som kan oppnås ved samdyrking av kjerneplanter (indre rom) i en endotelcellebelastet type-1 kollagenhydrogel (ekstrinsisk rom).
Samlet sett har assembloidmodellsystemet som presenteres her flere kritiske trinn å fremheve. For det første er modellsystemet bare så godt som kvaliteten på komponentene. Det er viktig å sjekke kjerneeksplanten og de sådde cellepopulasjonene under mikroskopet før monteringsprosessen starter. Det er tilsvarende viktig å verifisere fenotypen til de isolerte cellepopulasjonene minst én gang med flowcytometri. Spesielt når en ny gruppe kollagen-1 brukes for første gang, er det fordelaktig å sjekke kryssbindingshastigheten i en prøvekjøring før du legger inn celler i den. Assembloid-enheten krever mye manuell håndtering, noe som øker risikoen for infeksjoner. For å minimere risikoen for infeksjoner, arbeid i en steril biosikkerhetshette med laminær luftstrøm, bytt hansker ofte og dekontaminer hanskene og arbeidsplassen med 80% etanol. Av lignende grunner må du ikke bruke de 3D-printede klemmeholderne mer enn én gang. Før selve innebyggingsprosessen er det viktig å holde alle hydrogelkomponentene (tverrbindingsløsning, kollagen-1-løsning) på is for å forhindre for tidlig tverrbinding. Følgelig må man jobbe raskt når cellene er tilsatt til tverrbindingsløsningen for å begrense celledød på grunn av den høye pH og lave temperaturen i tverrbindingsløsningen. For å forhindre tørkerelatert celledød i kjerneeksplantasjonen, aspirer mediet som dekker de klemte kjerneeksplantene umiddelbart før du blander tverrbindingsløsningen med kollagen-1-løsningen. For å garantere den sentrale plasseringen av kjerneeksplanten i hydrogelen, er det ideelt å kaste hydrogelen rundt en klemt kjerneeksplant som er litt spennet. For å gjøre dette, bruk pluggstiften og M3 x 16 mm boltskruen for å feste klemmeholderne til et (3D-trykt) platesett med hull i passende lengder. Etter polymerisasjonstiden på 50 minutter kan den innebygde kjerneeksplanten spennes igjen avhengig av de ønskede kulturforholdene. Mengden spenning assembloiden opplever under kultur har en dyp innvirkning på eksperimentelle utfall og skal holdes jevn på tvers av prøver og forhold21.
Ikke desto mindre er den store effekten av mekanisk (ikke-)belastning på eksperimentelle utfall en hovedfordel med assembloidmodellen fremfor de fleste vevskonstruerte alternativer, spesielt siden den vedlikeholdte matrisesammensetningen til kjerneeksplanten også bør gjenskape de komplekse in vivo-lastemønstrene på cellenivå90. Mens det i praksis bare er vist måling av den lineære elastiske modulen, maksimal strekkbelastning og maksimal strekkfasthet for assembloider så langt, er protokoller for utmattingsstyrke og spenningsavslappingsmålinger beskrevet for senekjerneeksplanter andre steder og bør gjelde for assembloidene91,92. I tillegg til in vivo-lignende lastemønstre, er assembloidens modularitet på flere nivåer sannsynligvis den største fordelen. Takket være de individuelle kulturkamrene kan et kontrollerbart sett med nisjeforhold stilles inn for hver prøve separat (dvs. temperatur, oksygenspenning, glukosekonsentrasjon, tilskudd, stimulatorer, hemmere og statisk strekk med en plate). Deretter kan matriksstivhet og matrikssammensetning av det ytre rommet tilpasses gjennom hydrogelsammensetningen og vil for eksempel tillate å studere virkningen av et stadig sykere vevsmikromiljø ved å inkorporere mer kollagen-3 og cellulært fibronektin 93,94,95. De vurderte cellepopulasjonene i det ytre rommet kan enkelt tilpasses ved å velge hvilke celler som skal frøes, men kan også modifiseres i senekjerneeksplanten ved å utnytte etablerte genetisk modifiserte cellelinjer og muselinjer (dvs. ScxLin-celleuttømming)96. Den forskjellige matrisen og cellesammensetningen til de to rommene gir videre en unik oppdelt 3D-struktur som er et annet sentralt senekjennetegn 1,30,46.
Når du bruker dette systemet, er det viktig å vurdere konsekvensene av systemets modularitet for granulariteten til utfallsparametrene. Mens celleproliferasjon og rekruttering kan vurderes for hvert rom separat, er de mekaniske egenskapene, sekretomkomponentene og nedbrytningsproduktene for tiden bare målbare for hele assembloiden. Når det gjelder gjennomstrømning, kan en riktig trent person forberede opptil 50 assembloider på en vanlig arbeidsdag, med den viktigste flaskehalsen som klemmeprosedyren. Mens noen av avlesningsmetodene utelukker hverandre, er det mulig å vurdere mekaniske egenskaper og sekretomkomponenter gjentatte ganger på samme prøve, samt enten cellepopulasjonssammensetning (flowcytometri), celletranskriptom (RT-qPCR, RNA-sekvensering) eller matrise og cellefordeling (immuncytokjemi/fluorescensmikroskopi) ved endepunkter. I tidligere publikasjoner har disse metodene blitt brukt til omfattende karakterisering av intercellulære, tverrkompartmentale interaksjoner i kjerne // fibroblast og kjerne // makrofagassembloider utsatt for en lesjonslignende nisje84,85. I dette arbeidet har evnen til assembloidmodellsystemet til å undersøke det tverrkompartmentale samspillet mellom kjernen og ekstrinsiske endotelceller under forskjellige mikromiljøstimuli blitt utforsket.
Modulariteten til modellsystemet muliggjør fremtidig forfining av metoden, noe som er nødvendig for å overvinne følgende begrensninger i den nåværende designiterasjonen. Den flowcytometriske analysen som ble presentert i dette arbeidet og encellede RNA-sekvenseringsdata publisert nylig avslørte at senkjerneresidente tenocytter og akillesseneavledede populasjoner er mer heterogene enn tidligere antatt: 24,34,59,84,97. I tillegg uskarper den migrerende oppførselen til opprinnelig kjerne- eller hydrogel-residente cellepopulasjoner assembloid compartmentalization under kultur. Begge faktorene sammen gjør det utfordrende å tilskrive transkriptomiske forskjeller til spesifikke celletyper og å skille spredning fra migrasjonsbaserte prosesser. Denne begrensningen kan overvinnes ved å raffinere inngangspopulasjonen med fluorescensaktivert cellesortering (FACS) basert på den cellulære sammensetningen av friske eller syke sener karakterisert i nyere in vivo-studier, forbedre avlesningen ved å implementere enkeltcelle RNA-sekvensering og integrere proliferasjonsmarkører som en EdU (5-etynyl-2′-deoksyuridin) farging under mikroskopi.
Assembloidene som presenteres her deler også en svakhet med de fleste av de tilgjengelige in vitro-systemene som simulerer syke organer koblet fra resten av kroppen98,99. Imidlertid posisjonerer den kulturkammerbaserte plattformen som brukes her, modellsystemet godt for integrering i en multiorganplattform hvor assembloider som etterligner forskjellige organer er koblet sammen og interorganinteraksjoner kan studeres.
I kjernen er modellsystemet basert på posisjonelle gnagersener, noe som resulterer i sitt eget unike sett med ulemper. For det første hemmes oversettbarheten av resultatene av villtypemus som ikke utvikler seg eller lider av senesykdommer 8,100,101. Integrering av vev og celler fra mennesker eller nyutviklede musestammer som viser aspekter av senesykdom, kan lindre dette problemet102. Byttet mot en menneskebasert assembloid er spesielt interessant, da det vil muliggjøre studier med pasientavledede vev fra forskjellige syke sener (dvs. tendinitt, tendinose eller peritendinitt) og til og med behandlingsresistente givere som kan låse opp mer personlige behandlingsprogrammer. For det andre håndterer ikke murine haleseneplanter overbelastningsindusert mikroskade spesielt godt, noe som begrenser anvendeligheten av modellsystemet for studier av akutt seneskade.
Av alle disse grunnene er explant // hydrogel assembloider i en førsteklasses posisjon for å studere senkjernebiologi, matrisestruktur-funksjonsinteraksjoner og tverrkompartmentale interaksjoner mellom spesifikke cellepopulasjoner som svar på nisjeindusert mikroskade. Innsikt samlet fra disse ganske høy gjennomstrømningsstudiene kan gi retning til in vivo forskning og behandlingsutvikling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av ETH Grant 1-005733
0.4 mm x 25 mm injection needle (G27) | Sterican | 9186174 | |
3D printing filament: Clear polylactic acid prusament | Prusa | NA | |
4% formaldehyde | Roti-Histofix | P087.4 | |
Accutase cell detachment solution | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Amphotericin | VWR | L0009-100 | |
Attachable digital C-mount camera: Moticam 2 | Motic | NA | |
Bolt screw M3 x 16 mm, stainless steel | RS PRO | 1871235 | |
Bolt screw M3 x 6 mm, stainless steel | RS PRO | 1871207 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
CD146 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 134703 | |
CD206 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 141709 | |
CD31 antibody: Alexa Fluor 488 anti-mouse | BioLegend | 102413 | |
CD86 antibody: PE anti-mouse | BioLegend | 105007 | |
Collagenase I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392-100ML | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 7000183 | |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
DMEM/F12 | Sigma | 7002211 | |
Dowel Pin, 3 mm x 16 mm, stainless steel | Accu | HDP-3-16-A1 | |
Dragon Skin 10 Slow/1 silicone | KauPO | 09301-004-000001 | |
Endopan 3 Kit | Pan-Biotech | P04-0010K | |
Endothelial cell growth supplement | Lonza | CC-3162 | |
Eppendorf safe-lock plastic tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 30121023 | |
Ethidium homodimer, EthD-1, 2 mM stock in DMSO | Sigma-Aldrich | 46043-1MG-F | |
F4/80 antibody: Apc/fire 750 anti-mouse | BioLegend | 123151 | |
Falcon plastic tube (15 mL) | Corning | 352096 | |
Falcon plastic tube (50 mL) | Corning | 352070 | |
Flow cytometer: LSR II Fortessa | BD Bioscience | 23-11617-02 | |
Gelatin | Invitrogen | D12054 | |
Hellmanex III alkaline cleaning concentrate | Sigma | Z805939-1EA | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
Hydroxyproline assay | Sigma-Aldrich | MAK008 | |
Image analysis software: Motic Images Plus 3.0 ML | Motic | NA | |
L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium Salt n-Hydrate | Wako Chemicals | 013-19641 | |
LSE Low Speed Orbital Shaker | Corning | 6780-FP | |
MEM non-essential amino acids | Sigma | 7002231 | |
Mouse macrophage-stimulating factor (m-CSF) | PeproTech | 315-02-50ug | |
MSD assay | Mesoscale Discovery | various | |
NucBlue | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Nylon mesh strainer cap, 100 µm | Corning | 734-2761 | |
Original Prusa i3 MK3S 3D printer | Prusa | i3 MK3S | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), ph 7.4, sterile, 10 L | Gibco | 10010001 | |
Puromycin | Gibco | A1113803 | |
RBC lysis buffer | VWR | 786-650 | |
recombinant m-CSF | PeproTech | 315-02 | |
RNA extraction kit: Rneasy plus Micro | Qiagen | 74034 | |
Slicing software: PrusaSlicer | Prusa | NA | Version 2.6.0 or higher |
Sterile Cell Strainer 100 µm | Fisherbrand | 22363549 | |
Surgical scalpel blade No. 21 | Swann-Morton | 307 | |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Trypsin-EDTA (0.5 %) | Gibco | 15400054 |