創薬応用のための全ヒト肝培養システム

Summary

最近の技術的進歩により、薬物代謝および毒性アプリケーション用の in vitro プラットフォームの大規模な生産が可能になりました。全ヒト2D+肝臓系(TV2D+)は、従来の2次元培養法を用いて生理学的に適切な結果を提供します。このプロトコルは、システムのセットアップ、メンテナンス、およびアプリケーションにおいてエンドユーザーをサポートします。

Abstract

薬理学的および毒物学的研究のために、初代ヒト肝細胞(PHH)の長期的でヒトに関連する培養モデルを見つけることは、依然として課題です。現在の in vitro モデルプラットフォームは、多くの場合、不便で複雑であり、経時的な表現型安定性に欠け、複数のPHHロットをサポートしていないため、実験の再現性と柔軟性に欠けています。ここでは、より複雑な3次元(3D)システムに通常付随する寿命と表現型の安定性を経時的に維持しながら、標準的な2次元(2D)培養技術と機器を利用する、全ヒト2D+肝臓系(TV2D+)の融解、めっき、およびメンテナンスのための詳細なプロトコルを提供します。この結果は、PHH播種密度の関数としてのTV2D+の接着性とプレーティング率、および培養で少なくとも2週間安定した機能性を示しています。長期培養を成功させるために、さまざまなPHH播種密度が評価されます。TV2D+のPHHは、適切に確立されると、肝細胞コロニーに組織化され、肝臓特異的マーカーを発現し、生存率、構造的完全性、および生理学的に関連するレベルのアルブミンと尿素を維持します。このユニークな特性の組み合わせにより、TV2D+システムは、さまざまな薬理学的および毒物学的アプリケーションに適した肝臓モデルとなっています。

Introduction

治療の安全性と有効性の予測は、前臨床医薬品開発の重要な部分です。しかし、従来の前臨床in vitro肝モデルでは、in vivo肝細胞微小環境を正確に模倣し、肝細胞の機能と形態を経時的に維持する能力に限界がありました。代謝の遅い化合物を評価したり、亜急性または慢性曝露に関連する転帰を調査したりするために、1週間以上安定した代謝能力を提供するモデルが必要です。in vivo動物試験では、ヒトの肝クリアランスメカニズムにおける翻訳種の違いにより、薬効やリスクを予測できないことがよくあります¹。従来の初代ヒト肝細胞(PHH)の単一培養やサンドイッチ培養など、現在のin vitro 2次元(2D)肝モデルは、表現型の安定性と培養の寿命を欠いており、時間の経過とともに主要な肝細胞機能と構造的完全性が失われ^ます2。別の方法としては、3次元(3D)肝細胞スフェロイドの形成が挙げられ、2D培養よりも適切な微小環境を提供します。ただし、この方法は、原材料の入手可能性、PHHドナーロットの選択、再現性、およびスフェロイドサイズ^の増加に伴う生存率の低下によって制限されます3,4,5,6。PHHをフィーダー細胞で固定サイズのマイクロパターンプレートに播種する多細胞プラットフォームが導入されました。これらのモデルにより、より長い培養時間が可能になる可能性があるが、これらのプラットフォームで使用される非ヒトフィーダー細胞は、薬物クリアランスおよび代謝プロファイルへの生来のバックグラウンド寄与により、実験結果を変更し、その適用を制限する可能性がある^1,7。Weaver, et al⁸ で最近報告された TruVivo 全ヒト 2D+ 肝臓系 (TV2D+) は、PHH の従来の共培養法、および3次元培養法の限界に対処するために開発されました。非肝フィーダー細胞は、代謝およびパラクリン産生における種間差を減少させ、増殖、表現型、および性能の制限により、単一のドナーロットからの対応する非実質性肝細胞では提供できない、再現性のある堅牢な方法で初代肝細胞に必要なサポートを提供します。選択したフィーダー細胞は、使用前に一貫して増殖させることができ、形質転換や分化の必要がありませんでした。Glicklisら⁴およびKhetaniら5によって記述されている^{ように、肝}細胞スフェロイドのような3D培養モデルは、ドナーのばらつきやスフェロイドサイズの一貫性の維持による再現性に課題があり、200 μmを超えるスフェロイドの栄養拡散に影響を与え、生存率と機能性の低下につながります。3Dスフェロイド形成と同様に、TV2D+システムはPHHの自己組織化に依存しています。しかし、形成されたPHHコロニーは、単一の凝集体に圧縮されるのではなく、単一細胞の深さでウェルの表面積に分散しています。この培養方法は、ドナーのばらつきに対処するのに役立ち、PHHを播種し、培養し、さまざまな播種密度で基本的な機能を維持することを可能にします。また、TV2D+システムは、3Dスフェロイドで長時間培養を行うために必要な操作中の損失や特殊な機器によるユーザーハンドリングの堅牢性を高めることができます。

TV2D+システムは、標準的な2D培養と、3Dシステムに通常付随する寿命と表現型の安定性を兼ね備えています。本明細書に記載のプロトコルは、バイオセーフティキャビネット、遠心分離機、_CO2 インキュベーターなどの標準機器を備えた実験室で、基本的な組織培養スキルを持つユーザーに段階的な指示を提供します。培地の調製、解凍、プレーティング、得られた培養システムのメンテナンスなど、プロセスの各ステップが詳細に概説されています。このプロトコルには、基本的な肝細胞機能出力、アルブミン、尿素を決定する方法、および正常化のためのPHH付着を決定するための免疫蛍光画像解析も含まれています。適切に確立されると、TV2D+のPHHは肝細胞コロニーに組織化され、天然の肝臓の形態を模倣し、生存率、構造的完全性、および生理学的に適切なレベルのアルブミンと尿素を少なくとも^{2週間維持}します8。このシステムは、広範囲のPHH播種密度を可能にすることができるので、望ましいドナー特性を有する、よりプレーティング性の低いPHHロットの利用可能性を高めるのに有用であり得る。このアクセス性と機能性の組み合わせにより、TV2D+はさまざまな薬理学的および毒物学的アプリケーションに適した肝臓モデルとなっています。

Protocol

このプロトコルは、ライフネットヘルスの倫理委員会のガイドラインに従っています。この原稿には、著者が実施したヒトを対象とした研究や動物実験は含まれていません。すべての細胞は、ライフネットヘルスが研究目的で完全に同意したドナー組織から単離されました。 1. 培地の調製 フィーダーセル解凍培地、サプリメントA、サプリメントB、およびサプリメントC( 材料表を参照)をそれぞれ1本ずつ、37°Cのウォーターバスまたは4°Cで16〜24時間解凍します。 フィーダーセル融解培地のボトル全体(10 mL)を15 mLまたは50 mLのコニカルチューブに分注します。注:細胞ペレットのサイズは、15 mLのコニカルチューブを使用すると見やすくなります。 めっき剤1本(75mL)( 資料表参照)に、4.5mLのサプリメントBと11mLのサプリメントAを加えて、完全なめっき剤を作ります。注:完全なめっき媒体の濃度はFBS<5%v / vです。 別のボトルに、100 mLの培地( 材料表を参照)、1 mLのサプリメントC、および14 mLのサプリメントAを加えて、完全な培地を作ります。注:完全培地の濃度はFBS<1%v/vです。 残りのサプリメントCとサプリメントAは、2週目の培地調製まで-20°Cで保管してください。注:凍結融解サイクルを繰り返すと、サプリメントの保存期間が短くなります。凍結融解は1回のみにすることをお勧めします。 使用前に、フィーダー細胞融解培地、肝細胞融解培地、完全めっき培地、および完全培養培地10mLを37°Cのウォーターバスで20〜30分間加温します。 2. ヒトフィーダー細胞の融解、計数、プレーティング(図1A) PHHを播種する約1時間前にフィーダー細胞を培養し、フィーダー細胞( 材料表を参照)を37°Cのウォーターバスで1〜2分間解凍します。注:長時間の曝露(例:>2分)を避けて、バイアルの解凍を監視し、反転させたときにクライオバイアル内で液体が緩んだ場合は取り除いてください。 解凍後すぐに、フィーダーセルを氷の上に置きます。 無菌技術を用いて、バイオセーフティキャビネット(BSC)内で、新たに融解した細胞を10 mLのフィーダー細胞融解培地に添加します。 1000 μLのピペットを使用して、1 mLの細胞/融解培地懸濁液でバイアルを1回洗浄し、回収します。 室温(RT)で400 x g で4分間回転させます。 上清は、細胞ペレットを乱さないように、ピペッティングまたは真空吸引によって慎重に廃棄してください。細胞ペレットを1 mLの完全めっき培地に再懸濁し、フィーダー細胞をカウントします。注:フィーダー細胞は、自動セルカウンターでアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム(AOPI)を使用するか、血球計算盤を使用してトリパンブルーを使用してカウントできます。細胞数は、技術やユーザーによって異なる場合があります。最良の結果を得るには、重複するサンプルをカウントし、選択した方法論で一貫性を保ちます。 細胞懸濁液を100,000細胞/mLに希釈し、完全なめっき培地を使用します。 希釈した細胞懸濁液を1ウェルあたり500 μL(50,000細胞)を、コラーゲンでコーティングした24ウェルプレートに播種します( 材料表を参照)。 プレートを北(N)-南(S)-東(E)-西(W)の運動で、N-S方向に2回前後に動かし、その後同じ運動E-Wで振る。この振とうプロトコルをさらに2回繰り返し、合計3ラウンド行います。注:細胞の分布を補助しながら、プレートの蓋に飛び散らないように、適度な力で振とうを行ってください(ビデオを参照してください)。 37°C/5%CO2 で60分間インキュベートします。 肝細胞の融解に進む前に、フィーダー細胞の付着を確認してください。注:許容されるフィーダーセルの付着は、視覚的に約50%のコンフルエントです。 3. 初代ヒト肝細胞の融解、計数、プレーティング(図1B) 30分間のフィーダー細胞培養後、予熱した肝細胞融解培地を0.2 μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルターユニットでろ過します。 PHHを37°Cのウォーターバスで1〜2分間解凍します。注:長時間の曝露(例:>2分)を避けて、バイアルの解凍を監視し、反転させたときにクライオバイアル内で液体が緩んだ場合は取り除いてください。 解凍後すぐに、PHHを氷の上に置きます。 BSCでは、PHH懸濁液を肝細胞融解培地に注ぎます。注:可能であれば、PHH細胞懸濁液のピペッティングは避けてください。凍結したPHHをクライオバイアルから融解培地に移す際にピペッティングを行わないことが最も重要です。 1000 μLのピペットを使用して、1 mLの肝細胞/融解培地懸濁液をバイアルに静かにピペッティングし、解凍培地に注いで洗浄液を回収することにより、バイアルを3〜4回洗浄します。 解凍したPHH懸濁液に蓋をして、5回静かに裏返します。 室温で 100 x g で 8 分間スピンします。 上清は、細胞ペレットを乱さないように、ピペッティングまたは真空吸引によって慎重に廃棄してください。円錐形チューブの壁に、3 mLの完全なめっき媒体を追加します。 円錐形のチューブを左右に揺らして、細胞ペレットを再懸濁します。 再懸濁した肝細胞にさらに5 mLの完全めっき培地を加えます。 PHHを数えます。注:PHHは、自動セルカウンターでAOPIを使用してカウントするか、血球計算盤を使用してトリパンブルーを使用してカウントできます。細胞数は、技術やユーザーによって異なる場合があります。最良の結果を得るには、重複するサンプルをカウントし、選択した方法論で一貫性を保ちます。 完全なめっき培地を使用して、細胞懸濁液を所望の播種密度(300,000-600,000 PHHs/mL)に希釈します。注:最適な肝細胞播種密度は、ロットごとに異なる場合があります。特定のロットの推奨播種密度は、分析証明書(COA)に記載されています。以下の式を使用して、24ウェルプレートの肝細胞/mLを決定します。 播種したフィーダーセルから、ピペッティングまたは真空吸引により培地を除去します。注:フィーダーセルの生存率を確保するために、一度に交換するウェルは3つ以下にすることをお勧めします。 希釈した肝細胞懸濁液のウェルあたり500μL(150,000〜300,000細胞)を、フィーダー細胞を含むプレコートされたコラーゲン24ウェルプレートに直ちにプレーティングします。 N-S方向に前後に2回、同じ動きE-Wを使用して、プレートをN-S-E-Wの動きで振る。この振とうプロトコルをさらに2回繰り返し、合計3ラウンド行います。注意: 細胞の分布を補助しながら、プレートの蓋に飛び散らないように、適度な力で振とうを行ってください。 37°C/5%CO2 で2〜4時間インキュベートします。培養の最初の60分間は、上記のステップ3.15と同様に、N-S-E-W運動で15分ごとにプレートを振とうします。 インキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り外し、BSCに入れます。 プレートを振とうし、ピペッティングまたは真空吸引により完全なめっき媒体を除去します。注:培養の生存率を確保するために、一度に交換するウェルは3つ以下にすることをお勧めします。 予熱した完全培地500μLを直ちに各ウェルに加えます。 4. メンテナンス 37°Cのウォーターバスで20〜30分間分注し、完全培養液を予備温めます。 24ウェルプレート1枚に約13.5 mLの培地が必要です。 ウェルあたり500 μLの新鮮な予熱済み完全培地を毎日培養します。注:培養の生存率を確保するために、一度に交換するウェルは3つ以下にすることをお勧めします。 7日ごとに新しい完全培地を調製します。 5. アルブミン・尿素測定のための培養上清試料の採取 7日目、10日目、14日目に、 図1Cに示すように、目的のサンプルウェルから500 μLの培地を微量遠心チューブに集めます。 サンプルを 320 x g で 4 °C で 10 分間遠気し、破片をペレット化します。 ピペットを使用してサンプル上清を新しい微量遠心チューブに移し、ペレットの破壊を回避します。 アルブミンアッセイおよび/または尿素アッセイでサンプルを実行します(それぞれセクション10および11を参照)。注:サンプルは-20°C〜-80°Cで2週間保存できます。 6. 染色1日目 注意:固定バッファーにはパラホルムアルデヒドが含まれています。パラホルムアルデヒドは、眼の損傷、皮膚の炎症、臓器毒性を引き起こす可能性があります。換気の良い場所で作業し、適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。 14日目に培地サンプルを採取した後、図1Cに示すように、染色する各ウェルに300 μLの固定バッファー(材料表を参照)を添加します。最低2ウェルを染色します。 4°Cで20〜60分間インキュベートします。 5 mL の 10 倍ストック溶液を 45 mL の 1x PBS に加えて、1 倍透過処理バッファー( 材料表を参照)を調製します( 材料表を参照)。注:1x透過処理バッファーは、4°Cで1か月間保存できます。 氷上で300 μLの1x透過処理バッファーで2回洗浄します。 300 μL の一次抗体サイトケラチン 18( 材料表を参照)を、氷上の 1x 透過処理バッファーに 1:1000 の希釈液で添加します。注:少なくとも、1つのウェルを1x透過処理バッファーとインキュベートするのは、二次抗体のみのコントロールの場合に限ります。 4°Cで16〜24時間インキュベートします。 7. 染色2日目 翌日、ピペッティングまたは真空吸引により一次抗体を除去します。 ウェルあたり300 μLの1x透過処理バッファーを氷上で2回洗浄します。 1x透過処理バッファーに1:500希釈して300 μLの蛍光二次抗体( 材料表を参照)を加えます(二次コントロールのみを含む)。注:蛍光抗体を使用する際は、光を避けてください。 暗所で4°Cで30〜45分間インキュベートします。 二次抗体をピペッティングまたは真空吸引により除去します。 ウェルあたり300 μLの1x透過処理バッファーを氷上で2回洗浄します。 1 ウェルあたり 300 μL の 1x PBS で 1 回洗浄します。 150 μLの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)封入培地( 材料表を参照)を各ウェルに添加し、室温で暗所で15分間インキュベートします。注:プレートはパラフィルムで包み、暗所で4°Cで1週間保存できます。 蛍光顕微鏡で見る。10倍の対物レンズを使用して、各ウェルの特定の蛍光チャンネルの画像を5枚撮影します(1枚の画像にスケールバーがあることを確認してください)。注:DAPIの励起/発光は358 nm/461 nmです。DAPIと二次抗体蛍光色素の両方に適切な検出フィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用してください。 8. ImageJ解析(図2) 注: ImageJ バージョン 1.52a 以降を使用することをお勧めします。 縮尺記号を含む画像を ImageJ で開きます。[ 直線 ] アイコンをクリックし、縮尺記号の正確な長さに線を引きます [図 2 (1)]注意: 必要に応じて、 拡大鏡 アイコンをクリックしてズームインまたはズームアウトします。 [ 分析 ] タブをクリックします。[ スケールの設定]をハイライト表示してクリックします。 [既知の距離] を縮尺記号の距離に変更します。[長さの単位] を縮尺記号の単位に変更します。[グローバル] をオンにして、設定をグローバルに適用します。[OK] をクリックして縮尺を設定します。注:この設定を適用すると、開いたすべての画像に、ユーザーが入力した単位で計算された視野の領域が表示されます。 ImageJ で DAPI のみのイメージを開きます。[ プロセス ]タブをクリックし、[ 背景の減算]を強調表示します。染色されていない領域が黒くなるまで、一度に 50 ピクセルずつ背景を削除します。注: 画像に背景が含まれていない場合、この手順は必要ありません。 [イメージ] タブをクリックし、[タイプ] をハイライト表示します。8ビットをクリックすると、画像がグレースケールになります[図2(2)]。 手動または自動で画像を閾値設定して、すべてのDAPI粒子を含めます(手動で閾値を超えないように注意してください)[図2 (3)]。[ 画像 ] タブをクリックし、[ 調整] をハイライト表示します。 「しきい値」をクリックします。完了したら [ 適用 ] をクリックします。 [ プロセス ] タブをクリックし、[ バイナリ] を強調表示します。[ 集水域ラスターの作成 (Watershed)] をクリックします。 Analyzeタブをクリックし、Analyze Particlesをハイライト/クリックします[図2(4)]。Sizeを5-Infinityに、Circularityを0.00-1.00に設定します。[表示] ドロップダウン タブで、[アウトライン] を選択します。Display Results、Summarize、Include Holesがチェックされていることを確認します。[OK] をクリックします。注:しきい値によって背景ピクセルが生成される場合は、目的の粒子範囲を調整できます。 集計結果を TOTAL DAPIとして記録します。 マージされたサイトケラチン 18/DAPI イメージを ImageJ で開きます。 マルチポイント[図2(5)]アイコンを使用して、サイトケラチン18について染色されていないすべてのDAPI粒子を手動でカウントします。 結果を FEEDER CELLSとして記録します。以下の式を使用して、肝細胞DAPIを決定します。肝細胞 DAPI = 総 DAPI – フィーダー細胞 DAPI 9. 肝細胞の総接着量と接着率の定量(プレーティング性) 以下の式を使用して、24ウェル培養エリアのスケールファクターを作成します。視野の測定値は、開いた各画像の上部にあります[図2 (2)、緑色のボックス]。 以下の式を使用して、付着した肝細胞の総数を計算します。結合肝細胞 = 肝細胞DAPI×スケールファクター 以下の式を使用して、肝細胞の接着率を計算します。 10. アルブミンアッセイ 1:200に希釈したサンプルで、サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)( 材料表を参照)を使用してアルブミン産生を測定します。注:正確を期すために、ユーザーはサンプルが標準曲線の線形範囲内にあることを確認します。指定されたキットには、アッセイを実行するためのすべての材料と説明書が含まれています。 以下の式を使用して、付着した肝細胞に対するサンプル濃度を正規化します。 11. 尿素アッセイ 注意:血中尿素窒素(BUN)酸試薬には硫酸が含まれています。BUN酸試薬中の硫酸濃度は腐食性であると考えられています。摂取しないでください。換気の良い場所で作業し、適切なPPEを着用してください。 尿素合成は、修飾ジアセチルモノキシム法を用いて測定されます( 材料表を参照)。 尿素 53.3 μL の 75 mg/dL を 346.7 μL の完全培地に希釈して、スタンダード #1(100 μg/mL)を調製します。 チューブ 2-8 に標識し、1:2 の段階希釈液を使用して尿素アッセイ標準試料を作製します(表 1)。 10 μLのサンプルまたは標準試料を、黒壁の透明底の96ウェルプレートのウェルに加えます( 材料表を参照)。 150 μLのBUN試薬をサンプルを含む各ウェルに添加します。1/3のBUNカラー試薬と2/3のBUN酸試薬を混合して、BUN試薬を調製します。以下の式を使用して計算に役立ててください。BUN カラー試薬 (mL) = 必要な BUN 試薬総量 × 0.333BUN 酸試薬 (mL) = 必要な BUN 試薬の総量 × 0.667 プレートを60°Cのオーブンまたはインキュベーターで90分間インキュベートします。 540 nm と 650 nm のプレート吸光度をすぐに読み取ります。 すべてのサンプルと標準試料からブランク吸光度とバックグラウンド吸光度(650 nm)を差し引いて、検量線を作成します。線形回帰分析によって最適な線を生成します。 検量線から未知のサンプル濃度を決定します。 以下の式を使用して、付着した肝細胞に対するサンプル濃度を正規化します。

Representative Results

図1に示すように、肝培養系のプレーティング、培養、および基本的な機能性試験の全体的な方法には、一般的な初代細胞培養技術と分析が含まれます。肝細胞の接着率とプレーティング能は、サイトケラチン18の少なくとも5枚の画像のImageJ分析とウェルあたりのDAPI染色を使用して、14日目に計算しました(図2)。フィーダー細胞で培養したPHHの代表的な画像を図3に示します。種々の肝臓播種密度は、播種密度に基づく合流点の視覚的な違いを示し、14日間の培養の間、典型的な肝臓の直方体形態を維持した。肝細胞ドナーロットAおよびBの画像を、試験した播種密度ごとに撮影しました(図4A)。ドナーBの平均平坦性(89.04%±3.99%、198,552±49,885PHH)は、使用したすべての播種密度において、ドナーA(66.08%±6.67%、146,128±33,063PHH)よりも高かった(図4B)。ドナーAは、250,000-300,000 PHH/ウェル(62.75%±9.64%)と比較して、150,000 PHH/ウェル(76.07%±12.87%)を使用した平坦性の割合が有意に高かった。ドナーBは肝細胞のプレーティング性に有意差を示さなかった。ドナーBは、播種密度が最も高い300,000PHH/ウェルで、肝細胞のプレーティング性が最も低かった(85.78%±13.25%)。ドナーAと同様に、ドナーBを150,000PHH/ウェルで播種した方が、肝細胞のプレーティング率が最も高かった(94.75%±15.07%)。 アルブミン産生および尿素合成を14日間の培養期間中の3つの時点で測定し、計算された付着肝細胞に正規化しました。全体として、ドナーAはドナーBと比較してアルブミン産生が増加しました(41.32 ± 4.58 μg alb/day/106 PHHs vs vs 34.66 ± 10.03 μg alb/day/106 PHH)(図5)。ドナーAおよびBは、それぞれ150,000 PHH/well、45.91 ± 5.96 μg alb/day/106 PHH、48.67 ± 20.44 μg alb/day/106 PHHsと、肝細胞を播種するアルブミン産生が最も高かった。アルブミン産生に有意差は見られなかった。Baudy et al.3 が述べているように、肝臓の微小生理学的システムは、14 日間の培養で 50% 未満の変化で一貫したアルブミン産生と尿素合成を維持することが望ましいです。変動係数(CV)は、平均を7日目、10日目、および14日目の標準偏差で割ることによって計算されました。すべてのサンプルを重複して実行しました。150,000 PHH/ウェルでの 14 日間の培養期間におけるアルブミン産生の CV は、ドナー A で 12.24%、ドナー B で 37.97% であり、望ましい 50% 基準を下回りました。250,000 PHHs/ウェルで播種した場合、ドナーAとドナーBの両方でアルブミン産生の大きなばらつきが見られました。これらの播種密度では、両方のドナーは、培養の7日目、10日目、および14日目の間にアルブミン産生の急激な減少を経験します(CVドナーA、22.49%、およびドナーB、45.07%)。 ドナーBの尿素合成(95.09 ± 18.91 μg尿素/日/106)は、7日目、10日目、および14日目のPHHロット特異的データを平均すると、ドナーA(64.92 ± 4.66 μg尿素/日/106 PHH)と比較して増加しました(図6)。ドナーB(113.49 ± 37.34 μg尿素/日/106 PHH)およびドナーA(69.12 ± 17.06 μg尿素/日/106 PHH)は、それぞれ150,000 PHH/ウェルおよび200,000 PHH/ウェルの密度で播種し、14日間の培養期間にわたって最大の尿素合成を示しました。どちらのドナーロットも、尿素の排出量が最も低く、CVが300,000 PHH/ウェルと最も高かった。使用した播種密度に尿素合成に有意差は見られませんでした。ドナーAの尿素合成のCVが最も低かったのは、250,000 PPH/ウェル(23.11%)およびドナーB(28.26%)で200,000 PHH/ウェルで培養した場合でした。これらの結果から明らかなように、特定のロットのPHHに対する最適な播種密度は、アッセイ時に望ましいコンフルエントのレベルと測定される結果の性質によって異なります。シード密度が高いほど、シグナル・レンジやダイナミック・レンジが広くなるとは限りません。 図1:フィーダー細胞を用いた肝細胞のプレーティング、培養、機能試験のフローチャート。 (A)フィーダー細胞を特定の融解培地( 材料表参照)で融解し、完全プレーティング培地( 材料表参照)に再懸濁し、細胞をカウントする。細胞を希釈し、播種し、37°C/5% CO2で60分間インキュベートします。(B)肝細胞を特定の融解培地( 材料表参照)で融解し、完全めっき培地に再懸濁し、細胞をカウントする。肝細胞を希釈し、フィーダー細胞で播種します。細胞を37°C/5%CO2で2〜4時間インキュベートし、培養の最初の60分間は15分ごとにN-S-E-W運動で振とうします。めっき培地は、培養を維持するために予め温められた完全培養培地と交換されます( 材料表を参照)。培養物は毎日給餌されます。(C)7日目、10日目、14日目に、アルブミンと尿素の検査のために培地サンプルを採取します。14日目にサンプルを採取した後、細胞を固定し、サイトケラチン18( 材料表参照)抗体で4°Cで16〜24時間染色します。 さらに、適切な二次抗体中でインキュベートし、洗浄し、捕捉および画像解析のためにDAPI( 材料表を参照)とマウントします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:ImageJソフトウェアによる画像解析。キャプチャした画像のImageJ処理。 ステップ1:顕微鏡固有のスケールバーに基づいて、すべての画像にスケールが適用されます。ステップ2:画像の種類が変更されます。ステップ3:DAPIパーティクルを選択するために閾値制限が適用されます。ステップ4:粒子分析が実行され、カウントが記録されます。ステップ5:添付されたフィーダーセルの数を決定するために、マルチポイントツールを使用してマージされた画像をカウントします。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:フィーダー細胞で培養したさまざまな肝臓播種密度の形態。 150,000、200,000、250,000、および300,000PHH/ウェルの肝播種密度でフィーダー細胞(50,000細胞/ウェル)で培養したPHHの7日目および14日目の代表画像。画像は、倒立位相差顕微鏡で10倍の対物レンズを使用して撮影しました。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:フィーダー細胞で培養したさまざまな肝臓播種密度の蛍光免疫細胞化学。 (A)150,000、200,000、250,000、および300,000PHH/ウェルの肝播種密度での14日目のサイトケラチン18(赤)染色の代表画像。播種密度ごとに2つのウェルを4°Cで30分間固定しました。 ウェルを1:1000の一次抗体と4°Cで16〜24時間インキュベートしました。二次抗体を1:500、4°C、暗所で30分間使用しました。DAPI(青色)核染色を室温で15分間ウェルに添加した。画像は倒立蛍光顕微鏡で10倍の対物レンズを使用して撮影しました。スケールバー = 100 μm。 (B)ImageJを用いて計算した様々な肝臓播種密度の付着肝細胞およびプレーティング率。 *p ≤ 0.05、200,000、250,000、および 300,000 PHH/ウェルのプレーティング率。エラーバーは標準偏差を表します(条件ごとにn≥5画像)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:フィーダー細胞で培養した肝細胞のアルブミン産生。 150,000、200,000、250,000、および300,000PHH/ウェルでの肝播種密度からのアルブミン産生。列は、結合した肝細胞の総数に正規化されたアルブミン/日のマイクログラムの 14 日間平均を表します。線は、7日目、10日目、14日目の間のCVを表します。エラーバーは標準偏差(反復のある条件ごとにn ≥ 2ウェル)を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:フィーダー細胞で培養した肝細胞の尿素合成。 150,000、200,000、250,000、および300,000 PHH/ウェルでの肝播種密度からの尿素合成。カラムは、付着した肝細胞の総数に正規化した μg 尿素/日の 14 日間平均を表します。線は、7日目、10日目、14日目の%CVを表します。エラーバーは標準偏差(反復のある条件ごとにn ≥ 2ウェル)を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 スタンダード(S)# 濃度(μg/mL) 尿素水溶液(μL) 完全培養(μL) 1 100 53.375 mg/dLストック 346.7 2 50 100(S1ソリューション) 100 3 25 100(S2ソリューション) 100 4 12.5 100(S3ソリューション) 100 5 6.26 100(S4ソリューション) 100 6 3.125 100(S5ソリューション) 100 7 1.5625 100(S6ソリューション) 100 空砲 0 0 100 表1:尿素標準試料調製。 75 mg/dL のストック尿素を使用して、100 μg/mL の尿素溶液を調製します。推奨容量を分注して、検量線の最終濃度に到達します。

Discussion

記載された肝培養システムは、標準的な組織培養機器を備えた実験室で確立することができる。フィーダー細胞で培養したPHHで構成されており、安定したアルブミン産生と尿素合成でPHHを少なくとも2週間培養することができます。PHHドナーロットは変動するため、事前にスクリーニングされ、適格なPHHのみがシステムでの使用が推奨されます。結合したPHHの数はドナーロットと播種密度によって異なりますが、相対的なプレーティング性は各ドナーロット内で類似しています。推奨される播種密度が推奨されますが、上記のデータは、肝細胞の播種密度をさまざまな実験ニーズに合わせて調整できることを示唆しています。ただし、より多くのPHHを播種しても、より高い、またはより一貫性のある機能出力が得られない場合があることに注意する必要があります。評価したPHHロットの分析では、150,000 PHH/ウェルおよび200,000 PHH/ウェルの低い播種密度を使用したアルブミン産生および尿素合成において最も低いCVが示されました。しかし、アルブミンと尿素の間には、どの播種密度でも有意差は認められませんでした。播種密度が250,000 PHH/ウェルおよび300,000 PHH/ウェルと高いほど、14日間の培養期間にわたってアルブミンと尿素が大幅に減少します。ドナーのプレーティング性に固有のばらつきは、試験したドナーロットで 250,000 PHH/ウェルおよび 300,000 PHH/ウェルでのアルブミン産生および尿素合成の一貫性に影響を与える可能性があります。大きな肝細胞スフェロイドと同様に、TV2D+システムでPHHをオーバーシードすると、PHHの長期的な培養と機能に悪影響を及ぼす可能性があります。

解凍、めっき、メンテナンスのすべてのステップは、培養とデータ生成を成功させるために重要です。ただし、経験の浅いユーザーが回避できる一般的な間違いがいくつかあります。PHHは、温度変動、せん断応力、および空気への曝露に続発する損傷の影響を非常に受けやすい^9,10。PHHを解凍する際には、解凍期間の延長や過度のピペッティングを避けるための予防策を講じる必要があります。手作業で注ぐ方法、タイマー、およびウォーターバスから氷への即時転送を使用することで、PHHの生存率とプレーティング性に影響を与える可能性のあるこれらの一般的なエラーを減らすことができます。 さらに、サプライチェーンの問題がより一般的になると、コラーゲンコーティングされたプレートを入手することが困難になる可能性があります。この問題を克服するために、I型コラーゲン(5-10μg/cm²)の市販の溶液を使用した組織培養処理プレートの手動コーティングを使用できます。ただし、最適な性能と一貫性を得るには、コーティング済みのコラーゲンプレートを使用することをお勧めします。フィーダー細胞のみの培養からPHHの導入に移行する過程では、フィーダー細胞層の乾燥を防ぐことが重要です。フィーダーセルに空気をさらさないでください。空気曝露時間はフィーダー細胞層の品質低下につながり、PHHの長期培養に悪影響を及ぼす可能性があります。培地交換と培地交換の間に少量の残留培地を残せるようにすることがベストプラクティスです。時折、PHHには単離による過剰な破片が含まれていることがあり、形態の観察が困難になることがあります。この問題を解決するには、培地交換の前にプレートを振とうし、真空吸引を使用します。最後に、培地交換を行う場合は、培養細胞を乱さないように注意しながら、使用済みの培地を慎重に吸引します。新鮮な培地をウェルの側面にピペットで移し、細胞層に直接ピペッティングしないようにします。また、培地交換のたびに空気への曝露を避け、推奨される3ウェル交換(セクション3および4)を使用してください。また、毎日の培地交換が理想的ですが、必須ではないことにも注意してください。

蛍光顕微鏡はほとんどのラボで一般的になっていますが、特定の画像解析を実行するために必要なソフトウェアには追加費用がかかる場合があります。ImageJは無料でダウンロードでき、簡単にアクセスできる画像解析ツールです。プロトコルのステップは、ユーザーが最適化する必要がある基礎、特にDAPI染色の粒子分析を提供します。ただし、蛍光イメージング機能がない場合、14日目のPHH付着値はロット固有の分析証明書に記載されています。閾値が悪いと、DAPI粒子のカウントが不正確になります。また、サイズの除外を設定する前に、個々のDAPI粒子の表面積を確認することをお勧めします。これは、楕円形のアイコン[図2(1)]、[編集]タブの下の円のアイコンを使用して、DAPIパーティクルを囲む円を描画することで実現できます。その後、Analyzeタブを使用して、選択したDAPI粒子の面積を測定できます。特定の測定値は、[分析]タブの[測定値の設定]を使用して選択できます[ステップ8.9および図2(4)]。

PHHを培養するための現在の方法は、従来の2次元単培養¹¹において細胞接着を増加させるためにコラーゲンIなどのコーティングを使用すること、または一般に「サンドイッチ培養」と呼ばれる技術であるマウスベースのマトリゲルのような細胞外マトリックスと重ね合わせることを含む12,13,14,15。.サンドイッチ培養法は、従来の単一培養と比較して時間の経過とともにPHHの形態と極性を改善しますが、どちらのアプローチも、ほとんどのプレーティング可能なPHHの培養における長期的な表現型安定性に欠けています。PHHの培養に使用される別の方法は、3Dスフェロイドの作成です。しかし、Glicklisらが先に述べた^{ように4、}ドナーのばらつきにより、スフェロイドサイズの再現性には技術的な課題がある可能性があります。より生理学的に関連性のある肝臓モデルを作成するために、多細胞モデルが開発されました。Wareら7によって記述されている^{ように、マイクロ}パターニング、マウス線維芽細胞、およびPHHに囲まれた初代ヒト肝洞内皮細胞を使用することで、in vitroでの培養時間を長くすることができました。しかし、マイクロパターニングは複雑で時間のかかるプロセスであり、ヒト以外のフィーダー細胞が代謝シグナルのバックグラウンドに寄与する可能性があるため、特定のアプリケーションにおけるこのプラットフォームの有用性が制限されます。肝細胞の共培養のためのフィーダー細胞として、ヒトおよびラットの皮膚線維芽細胞およびウシ大動脈内皮細胞を含む様々な非肝細胞の使用は、肝臓起源のフィーダー細胞の共培養に類似したアルブミン分泌およびタイトジャンクション形成を示している¹⁶。しかし、TV2D+非肝フィーダー細胞と培養中のPHHとの相互作用のメカニズムは、このシステムにおけるPHHの安定性と機能への影響をよりよく理解するために、さらに調査する必要があります。Weaverらによって以前に報告された培養系⁸は、肝臓コロニーでPHHを最大42日間正常に培養し、広範な胆管ネットワークを形成することができます。この系で培養したPHHは、シトクロム1A2、2B6、3A4活性、ウリジン5′-ジホスホ-グルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)ベースの酵素活性、第I相および第II相代謝物形成、アルブミン産生、尿素合成などの主要な肝機能を維持しました。 この培養システムは、薬理学的および毒物学的アプリケーションのためにあらゆるラボに容易に適応できる、安定した生理学的に関連性のあるアウトプットを生成します。主要なPHH機能はTV2D+システムで維持されていますが、3D回転楕円体モデルとの直接比較は行われていません。しかし、培養系間で同じPHHドナーを比較する今後の研究は、両方の方法の限界と利点を決定する上で価値があることが証明されるでしょう。

TV2D+の応用例としては、代謝クリアランスの評価や低代謝性化合物の薬物間相互作用の評価、薬物誘発性肝障害、農薬のリスク評価などがあります。新薬や新薬の肝クリアランスを正確に予測するには、肝細胞の重要な機能を保持した安定した長期のPHH培養が必要ですが、これは低代謝回転化合物を評価する場合に特に困難です。さらに、リスク評価と化学物質誘発性肝毒性は主要な健康上の懸念事項であり、現在のモデルでは、急性曝露に続発する可能性のある潜在的な慢性化学物質毒性を正確に評価するための培養の長期的な安定性と機能性を提供していません。TV2D+で培養した健康なPHHと病気のPHHは、機能と脂質の性質に特徴的な違いを示し、それらは時間の経過とともに保持されました¹⁷。これらの研究は、TV2D+をさまざまな薬理学的および毒物学的用途の有望なツールとして支持しています。

Materials

0.2 µm PES  filter unit	Thermo Fisher Scientific	565-0020	User preference
15 mL or 50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	352196 or 352070	User preference
Alexa Fluor 555, goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Other secondary antibodies can work
Anti-Cytokeratin 18 antibody	abcam	ab24561	Necessary using same dilution
AOPI	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Used for Cellometer counting
Biosafety cabinet	Labconoco	3460801	User preference
Black-walled, clear bottom, 96-well plate	Thermo Fisher Scientific	165305	User preference
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Sorvall X4R	Capable of speeds up to 400 x g
Collagen coated plate, 24-well	Greiner Bio-One	662950	Rat tail collagen coating
Counting slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002	Used for Cellometer counting
Culture medium	LifeNet Health	MED-TCCM
Culture supplement	LifeNet Health	MED-TCSC
DAPI	Thermo Fisher Scientific	00-4959-52	Contains mounting medium
DPBS (-Ca, -Mg)	Thermo Fisher Scientific	14190250	User preference
Feeder cell supplement	LifeNet Health	MED-TCSA
Feeder cell thawing medium	LifeNet Health	MED-FCTM
Fluorescent microscope	Zeiss	AxioObserver Z1	Equipped with user specific filters
Hepatocyte thawing medium	LifeNet Health	MED-HHTM4C-50ML
Human albumin ELISA kit	abcam	ab108788	Necessary if using same dilution
Human feeder cells	LifeNet Health	PHFC24
Humidified incubator	VWR	97025-842	Capable of 5% CO2
IC Fixation buffer	Thermo Fisher Scientific	00-8222-49	Paraformaldehyde based, 10% formalin can also be used
ImageJ	National Insitute of Health	Version 1.52a	1.52a or higher
Inverted phase contrast microscope	Olympus	CK40-F100	User preference
Microcentrifuge tubes	VWR	20170-022	User preference
Micropipettes (various sizes)	USA Scientific	ErgoOne	User preference
Permeabilization buffer (10x)	Thermo Fisher Scientific	00-8333-56	Other permeabilization buffers can work
Plate reader	BMG Labtech	CLARIOstar	Capable of reading absorbance 450-640 nm
Plating medium	LifeNet Health	MED-TCPM
Plating supplement	LifeNet Health	MED-TCSB
Primary human hepatocytes	LifeNet Health	various	Catalog number may vary based on lot number
Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21428	User preference
Serological pipet controller	Gilson	F110120	User preference
Storage bottle 100–500 mL	VWR	76311-770	User preference
Urea Nitrogen (BUN) Test	Stanbio	0580-250
Water bath	PolyScience	WBE05	Capable for use at 37 °C