Addestrare i conigli da laboratorio a perfezionare le procedure di allevamento di routine

Summary

Sono stati sviluppati protocolli di addestramento che coinvolgono il rinforzo positivo per le procedure di allevamento di routine nei conigli e si sono dimostrati efficaci, poiché i conigli hanno mostrato in modo affidabile i comportamenti addestrati all'esame generale settimanale. Raccogliere i conigli con la scatola di trasporto era meno avversivo della tecnica di manipolazione convenzionale.

Abstract

Sono necessarie tecniche di manipolazione e addestramento non avverssive per gli animali da laboratorio per facilitare le procedure di allevamento sperimentali e di routine, migliorando sia il benessere degli animali che la qualità scientifica. L'addestramento con il clicker è stato utilizzato per sviluppare protocolli di addestramento per i conigli per perfezionare le procedure di routine stressanti solitamente associate al sollevamento (cioè essere sollevati dal pavimento) / trattenerli (cioè essere tenuti tra le braccia di un essere umano). Tredici femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda sono state addestrate in tre settimane. Tutti i conigli hanno imparato i comportamenti obiettivo predefiniti: hanno seguito il bastone bersaglio, sono saltati sulla bilancia, sono entrati in una scatola di trasporto e si sono impennati appoggiando le zampe anteriori sulla mano dell'addestratore. Inoltre, dieci animali sono saltati dal pavimento sulle ginocchia dell'addestratore seduto e hanno permesso all'addestratore di sollevare le zampe dalla superficie mentre era seduto sulle ginocchia dell'addestratore. Per alcuni individui, i protocolli hanno dovuto essere adattati con ulteriori passaggi intermedi. Alla fine dell'addestramento, i conigli hanno mostrato in modo affidabile i comportamenti attesi all'obiettivo, anche dopo brevi e lunghe pause di addestramento. Con poche eccezioni, una persona familiare diversa dall'addestratore poteva suscitare i comportamenti obiettivo dai conigli (generalizzazione), anche se erano necessarie ulteriori sessioni per la generalizzazione. Nel test di approccio volontario, i conigli hanno preferito interagire con l'addestratore nel 1^{° tentativo} , ma hanno trascorso tanto tempo con una persona sconosciuta quanto con l'addestratore nel 2^° tentativo. Le osservazioni comportamentali hanno suggerito che raccogliere i conigli con la scatola di trasporto, come descritto nel protocollo, invece di trattenerli con la collottola e sollevarli sul braccio, era meno avverso. Tutto sommato, i protocolli di addestramento erano fattibili e possono servire come strategia di perfezionamento nelle strutture per animali da laboratorio. Nell'interesse del benessere degli animali, i protocolli di addestramento dovrebbero essere applicati ove possibile.

Introduction

Tra il 2015 e il 2019, più di 49 milioni di animali sono stati utilizzati per scopi scientifici nell'Unione Europea (e in Norvegia); 1.745.037 (3,5%) di loro erano conigli¹. I conigli sono utilizzati principalmente per la ricerca normativa (ad esempio, controllo qualità, tossicità e altri test di sicurezza, inclusa la farmacologia) e la produzione di routine di sostanze biologiche (ad esempio, prodotti a base di sangue)². Sebbene siano stati compiuti sforzi per sostituire gli esperimenti sugli animali con metodi privi di animali, l'uso di animali è ancora necessario per alcuni di questi scopi. Ogni volta che un esperimento sugli animali non può essere sostituito, è fondamentale ridurre il numero di animali e perfezionare le condizioni sperimentali, di stabulazione e di allevamento per ridurre al minimo la sofferenza. Russel e Burch hanno descritto questa strategia come il principio delle 3R (sostituire, ridurre, perfezionare) nel 1959³ e, nel 2010, è stata implementata nella Direttiva 2010/63/UE sulla protezione degli animali da laboratorio utilizzati a fini scientifici⁴. Il ruolo di raffinamento, a volte indicato come "Cenerentola" delle 3R⁵, ha acquisito un'importanza crescente. Sebbene la sostituzione e la riduzione siano strategie a lungo termine verso l'obiettivo finale della direttiva di sostituire completamente gli esperimenti sugli animali, il perfezionamento consente il miglioramento immediato del benessere degli animali⁵, che a sua volta ha il potenziale per migliorare la qualità scientifica⁶. Le parti essenziali del perfezionamento sono la manipolazione e l'addestramento degli animali, come indicato nell'allegato III della direttiva 2010/63/UE. La direttiva stabilisce che le strutture per animali dovrebbero progettare programmi di assuefazione e addestramento per gli animali da laboratorio adattati alla specie, alla procedura e al progetto⁴. L'Appendice A dell'ETS n. 123 suggerisce che il personale degli animali da laboratorio trascorre del tempo "parlando, maneggiando, addestrando e pulendo gli animali"⁷.

Alcune procedure di manipolazione causano stress, specialmente per gli animali da preda terrestri come i conigli. Esempi sono l'essere messi all'angolo, trattenuti (cioè afferrati da un essere umano, tenuti tra le braccia di un essere umano o immobilizzati da un dispositivo) e sollevati (cioè raccolti dal pavimento) per un'ispezione sanitaria o procedure sperimentali⁸. Un sondaggio incentrato sui conigli domestici ha rivelato che il 57-61% di loro ha lottato quando è stato sollevato ^9,10 e alcuni hanno persino mostrato aggressività correlata alla paura (cioè mordendo)¹¹. Ciò sottolinea la necessità di tecniche di manipolazione e allenamento delicate. È già stato dimostrato per altri piccoli mammiferi come i topi che le tecniche di manipolazione delicata riducono l'ansia¹². Inoltre, la manipolazione delicata in combinazione con l'allenamento riduce lo stress, l'ansia e il comportamento simile alla depressione nei topi¹³. Nei macachi rhesus e negli scimpanzé, le misure fisiologiche relative allo stress erano meno influenzate quando erano stati precedentemente addestrati su una procedura^14,15. Si può presumere che se un animale può scegliere di partecipare volontariamente all'addestramento, può impegnarsi attivamente e controllare la situazione, il che migliora il benessere dell'animale e può anche contribuire a dati scientifici più solidi e affidabili¹⁶.

Molte procedure di addestramento degli animali si basano su principi di condizionamento operante, in particolare l'uso del rinforzo positivo e della modellatura 17,18,19. Il condizionamento operante richiede che un animale susciti comportamenti che possono quindi essere aumentati o diminuiti²⁰. Ci sono quattro contingenze comuni che vengono utilizzate per descrivere il condizionamento operante: rinforzo positivo e negativo, nonché punizione positiva e negativa^21,22. Nei conigli, la punizione positiva viene utilizzata quando una persona si avvicina (stimolo indesiderato) a un animale per allontanarlo o avvicinarlo a una particolare posizione²³. Nel contesto della manipolazione di un coniglio sul lettino da visita, un esempio di rinforzo negativo è la rimozione della pressione (stimolo indesiderato) sul corpo del coniglio quando il coniglio rimane fermo; Un esempio di punizione negativa è il ritiro di una ricompensa alimentare (stimolo desiderato) quando il coniglio inizia a lottare. Né la punizione positiva/negativa né il rinforzo negativo sono raccomandati nell'addestramento degli animali. La punizione provoca effetti emotivi negativi²⁴, come l'angoscia come mostrato nei cani²⁵. Invece, il rinforzo positivo dovrebbe essere il metodo di scelta quando si addestrano gli animali^25,26. L'addestramento di rinforzo positivo (PRT) significa che uno stimolo desiderabile (ad esempio, una ricompensa alimentare) viene fornito dopo che l'animale ha mostrato un comportamento desiderato, il che aumenta la probabilità che l'animale mostri di nuovo il comportamento desiderato in futuro²⁷. Il PRT comporta spesso l'applicazione di un rinforzo condizionato. Un rinforzo condizionato (rinforzo secondario) di solito è uno stimolo neutro come un suono, che l'animale impara ad associare a un rinforzo incondizionato (rinforzo primario, ad es. ricompensa alimentare)²⁸. Dopo che l'animale ha mostrato il comportamento desiderato, viene immediatamente presentato il rinforzo condizionato, seguito dalla presentazione della ricompensa alimentare²⁶. Un esempio ben noto di PRT è l'addestramento con il clicker, in cui un clicker viene utilizzato per produrre un clic come rinforzo secondario²⁶.

L'addestramento dovrebbe seguire schemi prevedibili, che si ottengono progettando un protocollo di addestramento. Il protocollo di addestramento descrive come un comportamento obiettivo può essere raggiunto passo dopo passo (cioè la modellazione comportamentale) mentre ogni passo è definito da criteri oggettivi e dovrebbe essere^{facilmente realizzato}. Se l'addestramento segue un protocollo particolare, è possibile che il personale degli animali da laboratorio si alterni all'addestramento degli animali. È importante notare che il personale deve conoscere i principi delle tecniche di apprendimento e formazione per poterli applicare correttamente²⁶. L'addestramento degli animali spesso incorpora la modellazione comportamentale. La modellazione comportamentale a mano è stata deliberatamente utilizzata per la prima volta da Skinner e colleghi nei primi anni '40²⁹. Al contrario, nel lavoro precedente, Skinner si è piuttosto concentrato sul "fare piccoli cambiamenti nell'ambiente fisico al fine di implementare un programma di approssimazione successiva"²⁹. In un articolo pubblicato su Scientific American, ha spiegato che il rafforzamento di un comportamento aumenta la probabilità che il comportamento venga ripetuto, il che "rende possibile modellare il comportamento di un animale quasi come uno scultore modella un pezzo di argilla"³⁰. Da allora, la sagomatura ha avuto un'importanza crescente per gli animali in cattività 29,30,31,32. Per riprodurre e migliorare i protocolli di modellamento, è fondamentale valutare i protocolli in modo sistematico e oggettivo 33,34,35,36.

Una revisione sistematica e una meta-analisi recentemente pubblicate da Pfaller-Sadovsky et al. hanno scoperto che il rinforzo condizionato è stato studiato più frequentemente nei cavalli e nei cani, sebbene siano stati studiati anche gatti, bovini, pesci, capre e primati non umani³⁷. Nella scienza degli animali da laboratorio, il PRT è ampiamente utilizzato per i primati non umani 38,39,40 e i cani ^41,42. Inoltre, i maiali⁴³, le capre⁴⁴ e persino i piccoli mammiferi, come i topi¹³ e i ratti 45,46,47, sono stati addestrati con successo utilizzando un clicker in laboratorio. Per quanto ne sanno gli autori, l'introduzione del PRT per i conigli da laboratorio è stata segnalata solo raramente⁴⁸; La letteratura esistente sottoposta a revisione paritaria pubblicata diversi decenni fa è obsoleta e non soddisfa i criteri della moderna ricerca etica. Sebbene poche informazioni non sottoposte a revisione paritaria suggeriscano che i conigli possano essere addestrati con successo utilizzando il PRT⁴⁹, sembra esserci una mancanza di conoscenza sui protocolli di addestramento adeguati per i conigli ospitati in strutture per animali da laboratorio. Le ragioni sottostanti possono essere varie. Ad esempio, le tecniche di formazione utilizzate potrebbero non essere descritte in dettaglio negli articoli di ricerca o i dati vengono generati per la ricerca normativa e quindi non vengono pubblicati. Inoltre, i conigli potrebbero non essere l'obiettivo principale della ricerca sul perfezionamento poiché altre specie come topi e ratti sono più frequentemente utilizzate nella ricerca. Poiché i conigli possono mascherare molto bene lo stress e il disagio, il loro stato emotivo negativo quando vengono maneggiati può spesso rimanere non riconosciuto. Le dimensioni di un coniglio consentono agli esseri umani di trattenere questi animali per le procedure, mentre altre specie, come i primati non umani, non possono essere tenute con le mani per interventi simili senza essere gravemente^ferite. Tuttavia, questi fatti non dovrebbero impedire lo sviluppo o la condivisione di protocolli PRT per i conigli da laboratorio.

Per quanto riguarda i potenziali benefici del PRT, sono stati fatti i primi tentativi per colmare il divario di conoscenze sui protocolli di addestramento adatti per i conigli da laboratorio. Per facilitare le procedure di routine come la manipolazione, le ispezioni sanitarie e la pesatura, sono stati sviluppati protocolli di addestramento ed è stata valutata la loro fattibilità per le femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda. Sono stati effettuati confronti per valutare se la tecnica di manipolazione alternativa descritta nei protocolli di addestramento fosse meno avversiva della tecnica di manipolazione convenzionale e se i protocolli di addestramento potessero servire come misure di perfezionamento. La Figura 1 mostra il calendario del presente studio.

Mantenimento degli animali

Tredici femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda sono state ottenute da fonti commerciali (arrivo alla struttura per animali all'età di circa sette settimane di età). Gli animali erano privi di tutti i patogeni virali, batterici e parassitari elencati nelle raccomandazioni FELASA⁵¹. Durante lo svolgimento delle fasi del presente protocollo sono stati indossati indumenti e dispositivi di protezione (guanti, maschere, retine per capelli). Un gruppo di sei e un gruppo di sette animali sono stati alloggiati insieme in un recinto a pavimento di 2,8 m × 2,8 m (stabulazione a pavimento), rispettivamente. Il pavimento era ricoperto di materiale da letto in legno fine e traballante (autoclavato). Inoltre, il materiale di nidificazione e la lana di carta sono stati sparsi sopra la lettiera. Tre casette di plastica con due aperture ciascuna (37 cm × 60 cm; altezza 30 cm) e un tunnel di plastica (lunghezza: 58 cm; diametro: 16 cm) fungevano da rifugi. Inoltre, sono stati forniti articoli di arricchimento come blocchi di legno per rosicchiare, palline di fieno e salice e palline di snack piene di pellet di cibo, che cadono quando si sposta la palla. I conigli avevano libero accesso all'acqua del rubinetto, al cibo pellettato e al fieno e alla paglia sterilizzati in autoclave. Ulteriori informazioni sugli alimenti e sugli articoli di arricchimento sono elencate nella tabella dei materiali. La stanza degli animali veniva pulita il giovedì.

I conigli sono stati mantenuti in condizioni standard (temperatura ambiente e umidità relativa indicate come media ± deviazione standard: 20,3 ± 0,4 °C e 50 ± 5 %) con un ciclo luce/buio di 12:12 h (luce artificiale con ulteriore incidenza di luce diurna). Una radio è stata accesa 30 minuti prima dell'inizio della fase di luce per circa 8 ore per abituare i conigli ai rumori ambientali.

Protocol

Il mantenimento degli animali è stato approvato dall'autorità statale di Berlino ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", numero di autorizzazione: ZH3 - Istituto federale tedesco per la valutazione dei rischi, Berlino). I protocolli di formazione sono stati sviluppati nell'ambito dell'allevamento di routine per perfezionare procedure come la manipolazione, l'ispezione sanitaria e la pesatura. Poiché i protocolli di addestramento non hanno causato alcun dolore, sofferenza o danno e tutte le osservazioni sono state fatte nel contesto dell'allevamento di routine, questo studio non è stato considerato un esperimento sugli animali secondo la legislazione europea.

1. Requisiti generali per la formazione

NOTA: I seguenti punti sono generalmente richiesti per l'addestramento degli animali, indipendentemente dal presente protocollo.

1. Contrassegnare chiaramente gli animali per l'identificazione.
2. Assicurati di avere una ricompensa di alta qualità, ad esempio cibo molto appetibile.
3. Definire il piano di addestramento che includa tutti i passaggi verso il comportamento obiettivo, cioè il comportamento desiderato che l'animale dovrebbe mostrare.
   NOTA: il comportamento dell'obiettivo è modellato passo dopo passo, mentre ogni passaggio è definito da criteri oggettivi e dovrebbe essere facilmente realizzato.
4. Definisci se gli animali devono riuscire a eseguire l'80% o il 100% delle fasi di addestramento prima di procedere con la fase successiva.
5. Preparare la documentazione (ad esempio, Tabella supplementare 1).
6. Non addestrare gli animali quando sono di fretta e prestare attenzione ai manierismi, al tono di voce e alla velocità di movimento, cioè parlare dolcemente e con calma, muoversi lentamente e in modo prevedibile.
7. Testare i passaggi addestrati nel training precedente.
8. Non addestrare un animale quando lo stato di salute generale dell'animale è compromesso e/o l'animale non è interessato a interagire con l'addestratore.

2. Routine di allenamento per il presente protocollo

NOTA: Per il presente protocollo sono state definite le seguenti routine di allenamento.

1. Allestire l'arena di addestramento nella stanza/recinto degli animali (Figura 2) e, a seconda del comportamento obiettivo da addestrare, posizionare la bilancia o il trasportino (pavimento 30 cm × 50 cm; porta 27 cm × 25,5; con un'apertura nel coperchio 16 cm × 39 cm) nell'arena.
2. Posiziona la bilancia e la scatola di trasporto fuori dall'arena per familiarizzare i conigli con questi nuovi oggetti prima che vengano addestrati i comportamenti obiettivo "pesatura" e "scatola di trasporto".
3. Per i comportamenti obiettivo (vedi passaggi 6-9), guida il coniglio nell'arena di addestramento, come descritto nel passaggio 5.7.
4. Siediti sul pavimento o usa uno sgabello/gradino basso su cui sederti nell'arena di allenamento.
5. Addestrare i comportamenti obiettivo uno dopo l'altro, nell'ordine descritto nel protocollo e non contemporaneamente. Fai un'eccezione se un animale non riesce ad apprendere un passaggio di un comportamento obiettivo per due giorni consecutivi - in questo caso, addestra contemporaneamente il comportamento obiettivo successivo. Cambia l'ordine dei comportamenti degli obiettivi se questo facilita il processo di formazione per un individuo.
6. Dopo l'assuefazione e l'introduzione del clicker, inizia ad addestrare tutti gli animali sul 1^° passo del comportamento obiettivo "seguendo il bersaglio" (cioè, la palla all'estremità della levetta del bersaglio è definita come bersaglio). Tieni presente che, a seconda delle loro prestazioni individuali, potrebbero raggiungere diversi livelli di allenamento in questo giorno. Continuare l'addestramento in base ai progressi individuali degli animali nei giorni successivi.
7. Pianifica una sessione di allenamento (ad esempio, circa 30 minuti per un gruppo con sei o sette animali) per ogni giorno lavorativo durante la settimana.
   NOTA: La sessione di addestramento inizia quando l'addestratore si trova nella stanza/recinto degli animali ed è pronto per iniziare l'addestramento. Una sessione termina quando nessuno dei conigli partecipa (più) all'addestramento o tutti i conigli hanno raggiunto la fase finale dell'addestramento del comportamento obiettivo da addestrare in questa sessione. Inizia ogni sessione di allenamento con l'ultimo passaggio riuscito del protocollo. Una sessione consiste in almeno una o più prove per animale.
8. Inizia una prova chiedendo all'animale di eseguire una particolare fase di addestramento (cioè la fase 3.1 dopo che il coniglio ha imparato a toccare il bersaglio con il naso/bocca) e termina la prova quando l'animale non partecipa (più) all'addestramento o l'animale ha raggiunto la fase finale dell'addestramento del comportamento obiettivo da addestrare. Al termine dell'addestramento, apri l'arena di addestramento e guida il coniglio fuori dall'arena; Quindi tieni il bastone bersaglio (con il bersaglio rivolto verso il soffitto) e la ciotola della ricompensa davanti al forziere.
9. Pianifica l'allenamento prima dell'alimentazione, della pulizia, dei trattamenti o delle procedure sperimentali.
10. Usa una ciotola di ricompensa con un clicker integrato (Figura 3, File di codifica supplementare 1) e, per alcuni comportamenti obiettivo, un bastone bersaglio aggiuntivo.
11. Riempi la ciotola della ricompensa con cibo appetibile, ad esempio semi di girasole e prelibatezze per il foraggiamento a base di cereali.
    NOTA: I conigli sono folivori e questi esempi di ricompensa non sono ottimali; Tuttavia, a causa delle restrizioni igieniche nella struttura per animali da laboratorio, erano le migliori alternative disponibili per questi animali. Se possibile, le erbe fresche dovrebbero essere preferite come ricompensa alimentare. Nota che una ricompensa è una ricompensa solo se il coniglio la favorisce davvero.
12. Assicurati di tenere sempre la ciotola della ricompensa nella stessa posizione, ad esempio davanti al forziere, e inizia a muovere la ciotola della ricompensa verso i conigli solo dopo il clic. Fatta eccezione per il comportamento obiettivo "impennarsi" e "saltare in grembo", tieni la levetta bersaglio in una mano e la ciotola della ricompensa nell'altra.
13. Presenta la ricompensa nel punto in cui si trovava il naso/bocca del coniglio quando il comportamento desiderato è stato mostrato correttamente.
14. Fai attenzione che il coniglio mangi solo una piccola quantità di cibo quando presenta la ricompensa.
15. Se un coniglio mostra il comportamento desiderato almeno quattro volte in un blocco di cinque tentativi (tasso di successo dell'80%), procedi con il passaggio successivo. Se un animale non è in grado di eseguire il passaggio successivo (cioè non riesce a eseguire il passaggio più di una volta), torna al passaggio precedente del protocollo. Se è stato necessario tornare a una fase precedente o un coniglio non partecipa all'addestramento, rivedere i protocolli di addestramento (ad esempio, definire fasi di addestramento più piccole), scegliere un'altra ricompensa alimentare (più appetibile) o verificare le capacità di addestramento dell'addestratore.
16. Se un coniglio esegue correttamente la fase finale dell'addestramento di un comportamento obiettivo, termina le sessioni di addestramento per questo coniglio lo stesso giorno.
17. Stampare il foglio di documentazione (Fascicolo supplementare 1), i protocolli di allenamento dettagliati e i protocolli di allenamento semplificati (Fascicolo supplementare 2) e allegarli a un blocco appunti o aprirli su un tablet. Utilizzare la scheda di documentazione per annotare le fasi di addestramento raggiunte dai singoli animali in ogni sessione.

3. Condizionamento/assuefazione contestuale

NOTA: Le sessioni di condizionamento/assuefazione contestuale vengono eseguite quotidianamente dall'addestratore e dai custodi degli animali per circa 15 minuti per gruppo di conigli per un periodo di cinque giorni consecutivi (dal lunedì al venerdì).

1. Parla dolcemente con i conigli.
2. Offri ricompense alimentari appetibili.
   NOTA: Tieni presente che improvvisi cambiamenti nella dieta possono causare problemi digestivi nei conigli. Pertanto, introduci lentamente la nuova ricompensa alimentare.
3. Sposta la ciotola della ricompensa piena di cibo appetibile verso i conigli e lascia che mangino da essa.
4. Tocca delicatamente i conigli intorno al collo, alle spalle, alla schiena e alla groppa senza trattenerli.

4. Introduzione del clicker

NOTA: Comportamento obiettivo: avvicinati al trainer e mangia la ricompensa dalla ciotola dopo il click. L'obiettivo è che il coniglio associ la ricompensa alimentare al clic, cioè il coniglio mangi la ricompensa alimentare dopo il clic.

1. Lascia che il coniglio si avvicini.
2. Fai clic una volta e sposta la ciotola della ricompensa verso il coniglio (indicato come click and treat o C e T).
3. Ripetere il passaggio 4.2 dieci volte. Quando fai clic per la decima volta, attendi un secondo prima che venga presentata la ricompensa e osserva il comportamento del coniglio.
   NOTA: Se l'animale cerca la ricompensa subito dopo il clic, si può presumere che il condizionamento del rinforzo secondario abbia avuto successo.
4. Ripetere i passaggi 4.1.-4.3. il giorno successivo se un coniglio non ha mangiato la ricompensa alimentare dopo il clic per almeno otto volte.

5. Seguire l'obiettivo

NOTA: Comportamento obiettivo: seguire e toccare il bersaglio con naso/bocca. I comportamenti obiettivo nelle sezioni 6-9 sono modifiche del comportamento obiettivo presentato nella sezione 5.

1. Posiziona il bersaglio vicino al naso/bocca del coniglio.
   NOTA: La palla all'estremità del bastone bersaglio è definita bersaglio.
   1. C e T quando il coniglio tocca il bersaglio con il naso/bocca.
      NOTA: Assicurati che il naso/bocca del coniglio non tocchi il bastoncino in un punto indefinito tranne la palla.
   2. Rimuovi il bersaglio dal campo visivo del coniglio mentre lo ricompensa.
   3. Ripeti tutti i passaggi precedenti per cinque volte fino a quando il coniglio non ha eseguito con successo questo passaggio per almeno quattro volte su cinque (percentuale di successo dell'80%).
2. Posiziona il bersaglio in un punto diverso dove può essere toccato con il naso/bocca con i movimenti della testa senza muovere tutto il corpo.
   1. C e T quando il coniglio tocca il bersaglio con il naso/bocca e seguire i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.
3. Posiziona il bersaglio a una distanza maggiore dal coniglio e lascia che il coniglio si allunghi verso di esso.
   1. C e T quando il coniglio tocca il bersaglio con il naso/bocca e seguire i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.
4. Aumenta ulteriormente la distanza tra il bersaglio e il coniglio richiedendo all'animale di fare un salto per raggiungere il bersaglio.
   1. C e T quando il coniglio tocca il bersaglio con il naso/bocca e seguire i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.
5. Posiziona il bersaglio proprio davanti al naso/bocca del coniglio in modo che il coniglio possa toccare il bersaglio e poi allontana lentamente il bersaglio dal coniglio. Assicurati che il coniglio faccia un numero variabile di salti per seguire il bersaglio.
   NOTA: In un blocco di cinque tentativi, la^1a,^2a,^3a, 4a e 5a^{volta il} coniglio viene ricompensato rispettivamente dopo 2, 1, 2, 3 e 2 salti (in media: dopo 2 salti).
   1. C e T quando i conigli hanno effettuato il numero richiesto di salti e segue i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.
6. Ripetere il passaggio 5.5 e spostare la destinazione attraverso il modellatore tra i due oggetti.
   NOTA: Per questo passaggio, due oggetti, ad esempio i tunnel, vengono posizionati parallelamente l'uno all'altro e formano un modellatore.
   1. C e T quando i conigli hanno effettuato il numero richiesto di salti e seguire i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.
7. Ripeti il passaggio 5.5 e sposta il bersaglio verso l'arena di addestramento in modo che il coniglio vi entri.
   1. C e T quando i conigli hanno effettuato il numero richiesto di salti e seguire i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.

6. Pesatura

NOTA: Comportamento obiettivo: Rimanere sulla bilancia per almeno un secondo. Se la superficie della bilancia è troppo scivolosa, è possibile posizionare un cuscinetto antiscivolo sulla parte superiore. Tuttavia, alcuni conigli tendono a rosicchiare il pad.

1. Guidare il coniglio con il bastoncino bersaglio verso la bilancia come descritto al punto 5.5.
   1. C e T quando il coniglio tocca il bersaglio con il naso/bocca.
   2. Rimuovi il bersaglio dal campo visivo del coniglio mentre lo ricompensa.
   3. Ripeti tutti i passaggi sopra descritti cinque volte fino a quando il coniglio non ha eseguito con successo questo passaggio per almeno quattro volte su cinque (percentuale di successo dell'80%).
2. Sposta il bersaglio leggermente sopra la scala in modo che il coniglio lo calpesti con le zampe anteriori per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 6.1.2 e 6.1.3.
3. Sposta il bersaglio leggermente oltre il centro della squama in modo che il coniglio lo calpesti con le zampe anteriori e si allunghi sulla squama per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 6.1.2 e 6.1.3.
4. Sposta il bersaglio oltre il centro della squama in modo che il coniglio salga sulla bilancia con le zampe anteriori e posteriori per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 6.1.2 e 6.1.3.
5. Condurre il coniglio sulla bilancia come descritto al punto 4.4. e attendi qualche secondo prima di C e T.
   NOTA: In questo passaggio, premia il coniglio dopo essere rimasto seduto per un periodo di tempo variabile sulla bilancia. In un blocco di cinque tentativi, il 1^°, 2^{°, 3°, 4}° e 5^{° volta,} il coniglio viene ricompensato rispettivamente dopo 0,5, 1,0, 2,0, 0,5 e 1,0 secondi (in media: 1,2 secondi). Mentre il coniglio rimane fermo durante questo periodo, il peso può essere letto dalla bilancia. Se la bilancia impiega più tempo per stabilizzarsi e misurare il peso, aumentare il tempo di seduta dell'animale sulla bilancia.
   1. C e T e seguire i passaggi 6.1.2 e 6.1.3.

7. Inserimento della scatola di trasporto

NOTA: Comportamento obiettivo: Entrare e uscire dalla scatola di trasporto. Per la sessione di allenamento, utilizzare un box di trasporto (pavimento 30 cm × 50 cm; porta 27 cm × 25,5 cm) con un'apertura nel coperchio (16 cm × 39 cm) il cui fondo è coperto con materiale da letto sporco.

1. Guidare il coniglio con il bastoncino bersaglio verso la scatola come descritto al punto 5.5.
   1. C e T quando il coniglio è davanti all'ingresso del box.
   2. Rimuovi il bersaglio dal campo visivo del coniglio mentre lo ricompensa.
   3. Ripeti tutti i passaggi sopra descritti cinque volte fino a quando il coniglio non esegue correttamente l'attività per almeno quattro volte su cinque (percentuale di successo dell'80%).
2. Tieni il bastoncino del bersaglio attraverso l'apertura del coperchio e spostalo nella scatola motivando così il coniglio a entrare nella scatola con le zampe anteriori.
   1. C e T e seguire i passaggi 7.1.2 e 7.1.3.
3. Segui il passaggio 7.2 e conduci il coniglio nella scatola (cioè, tutte le zampe anteriori e posteriori sono entrate nella scatola).
   1. C e T e seguire i passaggi 7.1.2 e 7.1.3.
4. Segui il passaggio 7.3 e chiudi lo sportello della scatola per alcuni secondi. Quindi riaprire la porta.
   1. C e T e seguire i passaggi 7.1.2 e 7.1.3.
5. Segui il passaggio 7.3 e chiudi lo sportello della scatola. Sollevare con cautela la scatola un po' (cioè a pochi centimetri dal pavimento). Rimetti la scatola sul pavimento e apri la porta.
   1. C e T e seguire i passaggi 7.1.2 e 7.1.3.
6. Segui il passaggio 7.5. Quindi porta il coniglio con il bastoncino bersaglio fuori dalla scatola.
   1. C e T e seguire i passaggi 7.1.2 e 7.1.3.

8. Allevamento

NOTA: Comportamento obiettivo: posizionare le zampe anteriori sul palmo della mano durante l'impennata. Per la sessione di allenamento, tieni in mano sia il bersaglio che la ciotola della ricompensa.

1. Posiziona il bersaglio sopra la testa del coniglio in modo che il coniglio allunghi il naso verso l'alto per toccare il bersaglio con il naso/bocca mentre tutte le zampe rimangono a terra.
   1. C e T.
   2. Rimuovi il bersaglio dal campo visivo del coniglio mentre lo ricompensa.
   3. Ripeti tutti i passaggi sopra descritti cinque volte fino a quando il coniglio non ha eseguito con successo questo passaggio per almeno quattro volte su cinque (percentuale di successo dell'80%).
2. Posiziona il bersaglio sopra la testa del coniglio, come descritto al punto 8.1. Dopo che il coniglio ha allungato il naso verso l'alto, sposta il bersaglio più in alto in modo che il coniglio sollevi le zampe anteriori da terra e tocchi il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 8.1.2 e 8.1.3.
      NOTA: Se il coniglio non riesce a eseguire 8.2, è possibile aggiungere un passaggio intermedio dopo 8.2. Per questo, segui 8.2 e poi avvicinati e tocca le zampe anteriori del coniglio (superficie palmare) con il palmo della mano libera. C e T e seguire i passaggi 8.1.2 e 8.1.3.
3. Posiziona il palmo della mano libera davanti al coniglio e sposta il bersaglio sopra la testa del coniglio in modo che il coniglio metta le zampe anteriori sulla mano per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T dopo un secondo e seguire i passaggi 8.1.2 e 8.1.3.
      NOTA: Mentre le zampe anteriori poggiano sulla mano dell'addestratore, l'addome del coniglio può essere ispezionato visivamente.

9. Saltare in grembo

NOTA: Comportamento obiettivo: salta in grembo all'allenatore e rimani seduto mentre vieni toccato. Per i passaggi 9.5-9.9, tieni sia il bastone bersaglio che la ciotola della ricompensa nella stessa mano poiché una mano deve toccare il coniglio.

1. Condurre il coniglio con il bastone bersaglio vicino all'addestratore come descritto nella fase 5.5 del protocollo.
   1. C e T quando il coniglio tocca il bersaglio con il naso/bocca.
   2. Rimuovi il bersaglio dal campo visivo del coniglio mentre lo ricompensa.
   3. Ripeti tutti i passaggi sopra descritti cinque volte fino a quando il coniglio non ha eseguito con successo questo passaggio per almeno quattro volte su cinque (percentuale di successo dell'80%).
2. Sposta il bersaglio sopra le gambe dell'addestratore in modo che il coniglio metta le zampe anteriori sulle zampe per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
3. Sposta il bersaglio sopra le zampe e leggermente più lontano dal coniglio in modo che il coniglio metta le zampe anteriori sulle zampe e si allunghi in avanti per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
      NOTA: Se il coniglio non riesce a eseguire 9.4, è possibile aggiungere un passaggio intermedio dopo 9.3. Per questo, segui il passaggio 9.3 e poi attira il coniglio con la ciotola della ricompensa in grembo. Quando il coniglio ha messo tutte e quattro le zampe in grembo, C e T e segui i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
4. Sposta il bersaglio sopra le gambe e ancora più lontano dal coniglio in modo che il coniglio salti in grembo per toccare il bersaglio con il naso/bocca.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
5. Seguire il passaggio 9.4. e accarezza con cura il coniglio con la mano libera dal cranio alla caudale (partendo dalla spalla) mentre il coniglio si siede in grembo.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
6. Segui il passaggio 9.4 e accarezza con cura le orecchie del coniglio con la mano libera dal cranio alla caudale mentre il coniglio si siede in grembo.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
7. Seguire il passaggio 9.4. e afferra delicatamente una delle orecchie del coniglio per ispezionare visivamente le orecchie.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
8. Seguire il passaggio 9.4. e accarezza una zampa anteriore o posteriore con la mano libera mentre il coniglio si siede in grembo.
   NOTA: Se il lato destro del corpo del coniglio è rivolto verso e il lato sinistro del corpo lontano dall'addestratore, le zampe sinistre possono essere toccate delicatamente (e viceversa). Assicurati di allenare entrambi i lati alternativamente.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.
9. Seguire il passaggio 9.4. e solleva con cautela una zampa anteriore o una zampa posteriore con la mano libera mentre il coniglio si siede in grembo.
   NOTA: Gli artigli possono essere ispezionati quando le zampe sono sollevate. Assicurati di allenare entrambi i lati alternativamente.
   1. C e T e seguire i passaggi 9.1.2 e 9.1.3.

Results

Nelle sezioni seguenti, vengono fornite informazioni su materiali e metodi che vanno oltre il protocollo insieme ai risultati rappresentativi.

Statistica

I dati ottenuti dal protocollo sopra citato sono stati memorizzati in fogli di calcolo e analizzati utilizzando un software per l'analisi statistica avanzata (Tabella dei materiali). Per i parametri continui sono stati effettuati test di normalità (ispezione visiva di istogrammi e grafici qq, confronto tra media, deviazione standard e mediana). Le differenze tra i parametri indagati nel test di approccio volontario (durata dell'interazione con l'allenatore e la persona sconosciuta, tocchi anteriori zampe-gambe) sono state analizzate utilizzando il test di grado firmato di Wilcoxon. Le differenze tra le tecniche di manipolazione sono state analizzate utilizzando il test del rango con segno di Wilcoxon o il test di McNemar (se binario). Le differenze sono state considerate significative a p < 0,05. Quando si utilizzava il test del rango con segno di Wilcoxon, la distribuzione delle differenze doveva essere simmetrica in base all'ispezione visiva dell'istogramma.

Lo studio è stato esplorativo. L'analisi della potenza basata sulla durata dell'interazione dei conigli con i "dispositivi di manipolazione" è stata eseguita dopo lo studio (test di Wilcoxon con rango firmato; potenza ≥ 0,999) utilizzando G*Power (versione 3.1.9.7)⁵².

Assuefazione

Tutti i conigli tranne i #4 e #10 hanno ingerito cibo dalla ciotola della ricompensa e hanno lasciato che l'addestratore li toccasse in tutte le sessioni di assuefazione. Il coniglio #4 non ha accettato la ricompensa alimentare nella^1a sessione, ma ha mangiato quattro volte dalla ciotola della ricompensa nella^2a sessione. La quantità di ricompensa assunta, tuttavia, aumentava nelle sessioni successive e anche il coniglio poteva essere toccato. Il coniglio #10 ha anche richiesto più tempo per abituarsi all'addestratore e alla ricompensa in cibo. Nella prima sessione il coniglio ha accettato la ricompensa alimentare dall'addestratore dopo 5 minuti ma non poteva essere toccato. Nella 2a sessione, l'interesse per il cibo non è stato osservato. Nelle sessioni successive, tuttavia, il coniglio #10 ha accettato sia ricompense alimentari che tocchi.

Presentazione del clicker

Dodici conigli su tredici hanno completato con successo la sezione 4 del protocollo in un giorno e hanno associato la ricompensa alimentare (rinforzo primario) con il clic (rinforzo secondario) all'interno di questa sessione di addestramento. L'associazione è stata testata osservando il comportamento dei conigli dopo che il clic è stato presentato per la decima volta. Quando un animale cercava la ricompensa subito dopo il clic, si presumeva che il coniglio associasse il rinforzo primario a quello secondario. Il coniglio #4 non ha mangiato la ricompensa alimentare dopo il clic del giorno 1. Il coniglio #4 ha impiegato un giorno in più (cioè due giorni) per associare con successo il clic e la ricompensa in cibo.

Seguire l'obiettivo

La tabella 1 fornisce il numero di sessioni di addestramento (fornite come mediana, 25^° percentile e 75^° percentile) necessarie per insegnare ai conigli i comportamenti obiettivo dei protocolli. Ci sono volute 2 sessioni di allenamento ai conigli (mediana) per seguire il bastone bersaglio nell'arena di addestramento (Tabella 1). Tutti i conigli hanno raggiunto la fase finale (5.7) di questo comportamento obiettivo.

Il coniglio #4 e il coniglio #7 hanno avuto bisogno rispettivamente di 7 e 8 sessioni di allenamento, prima di seguire il bastone bersaglio nell'arena di addestramento. Poiché il coniglio #7 non è riuscito a completare il passaggio 5.4 e non ha fatto un salto per seguire lo stick bersaglio, un ulteriore passaggio di addestramento (5.3+) è stato implementato nel protocollo dopo il passaggio 5.3. Nel passaggio 5.3+, il bastone bersaglio è stato posizionato a una distanza maggiore dal coniglio rispetto al 5.3 e il coniglio ha dovuto allungarsi verso di esso in direzioni diverse, ma il bastone bersaglio era ancora raggiungibile senza fare un salto. Il coniglio #4 ha avuto problemi con il passaggio 5.5 e non è stato in grado di seguire il bastone bersaglio, che era posizionato proprio davanti al naso/bocca, per un numero variabile di salti. Pertanto, al protocollo è stato aggiunto un ulteriore passaggio 5.4+. In questo caso, il bastone bersaglio è stato posizionato proprio davanti al naso/bocca del coniglio ed è stato quindi spostato in direzioni diverse richiedendo al coniglio di fare un salto. Lo stesso passaggio aggiuntivo è stato utilizzato con successo anche per il coniglio #7. Dopo aver completato le fasi di formazione aggiuntive con una percentuale di successo di almeno l'80%, sono stati in grado di continuare con i passaggi successivi.

Pesatura

I conigli hanno avuto bisogno di 1 sessione di addestramento (mediana) fino a quando non hanno eseguito il passaggio 6.5 (cioè, rimanere sulla bilancia per un periodo di tempo variabile) (Tabella 1). Tutti i conigli hanno raggiunto la fase finale (6,5) di questo comportamento obiettivo.

Inserimento della scatola di trasporto

I conigli hanno eseguito con successo tutti i passaggi da 7.1 a 7.6 (cioè entrare e uscire dalla scatola di trasporto dopo il sollevamento) entro 2 sessioni di allenamento (mediana) (Tabella 1). Tutti i conigli hanno raggiunto la fase finale (7.6) di questo comportamento obiettivo.

Quando i conigli #2 e #3 hanno eseguito con successo il passaggio 7.6 per la prima volta, non hanno voluto rientrare nella scatola di trasporto per ripetere questo passaggio. Pertanto, è stato creato il passaggio 7.5+: dopo che l'animale ha seguito il bastoncino bersaglio verso la scatola, la ciotola della ricompensa è stata tenuta attraverso l'apertura del coperchio e l'animale è stato attirato all'interno della scatola. Una volta che il coniglio è entrato nella scatola, la porta è stata chiusa e la scatola è stata sollevata con cura. Dopo aver riposizionato la scatola sul pavimento, la porta è stata aperta e il coniglio è stato condotto con il bastone bersaglio fuori dalla scatola. Entrambi gli animali sono riusciti a eseguire il passo 7.5+ per almeno 4 volte, seguito dal passo 7.6 il giorno successivo.

Allevamento

È stata necessaria 1 sessione di addestramento (mediana) fino a quando i conigli non hanno completato con successo il passaggio 8.3 (cioè posizionare le zampe anteriori sulla mano dell'addestratore) (Tabella 1). Poiché 11 conigli su 13 (cioè tutti tranne #3 e #7), non sono riusciti a eseguire il passaggio 8.3, per questi animali è stato definito un ulteriore passo di addestramento 8.2+ dopo 8.2. Nel passaggio 8.2+, il bastoncino del bersaglio è stato spostato sopra la testa del coniglio in modo che il coniglio sollevasse le zampe anteriori da terra e toccasse il bersaglio con il naso/bocca. Mentre il coniglio toccava il bersaglio, l'addestratore si è avvicinato e ha toccato le zampe anteriori (superficie palmare) con il palmo della mano libera. Dopo che il passaggio 8.2+ è stato eseguito con successo in almeno quattro tentativi su cinque, il passaggio 8.3 è stato nuovamente addestrato e completato.

Saltare in grembo

Sono state necessarie 2.5 sessioni di addestramento (mediana) per addestrare i conigli nelle fasi 9.1. al 9.9. (Tabella 1). Dieci conigli sono stati in grado di raggiungere il passo finale 9.9 (cioè, accettando che le loro zampe fossero toccate mentre erano seduti in grembo all'addestratore). Il coniglio #4 ha raggiunto solo il passo 9.2 (cioè, appoggiando le zampe anteriori sulle zampe dell'addestratore) e il coniglio #10 ha raggiunto il passo 9.3 (cioè, saltando in grembo all'addestratore). Il coniglio #7 ha raggiunto il passo 9.3+, che era un ulteriore passo intermedio dopo il passo 9.3. In questo caso, il coniglio ha posizionato le zampe anteriori sulle zampe dell'addestratore, come descritto nel passaggio 9.2, ed è stato quindi attirato con la ciotola della ricompensa in grembo all'addestratore. Una volta che tutte e quattro le zampe sono state posizionate in grembo all'allenatore, sono stati presentati il clic e la ricompensa. Questo passaggio è stato aggiunto con successo al protocollo per otto conigli per facilitare l'esecuzione dei passaggi successivi.

Generalizzazione

Per valutare se i conigli generalizzassero gli indizi addestrati per eseguire i comportamenti obiettivo con persone diverse dall'addestratore, una custode animale femmina, che aveva familiarità con i conigli ma aveva solo poche esperienze precedenti nell'addestramento con il clicker, ha chiesto ai conigli di eseguire i comportamenti obiettivo addestrati "pesare", "entrare nella scatola di trasporto", "impennarsi" e "saltare in grembo". Se un coniglio non ha precedentemente imparato la fase finale del "salto in grembo", dovrebbe essere dimostrata l'ultima fase di addestramento riuscita.

Le sessioni si sono svolte in cinque giorni consecutivi dopo il completamento della formazione di 3 settimane (Figura 1). Il custode degli animali ha letto i protocolli di addestramento prima della^1a sessione. All'inizio della^1a sessione, l'allenatore ha dato una breve dimostrazione di tutti i comportamenti degli obiettivi. Poi è rimasta nel recinto, ha dato istruzioni durante le sessioni e ha documentato quale passo dei comportamenti dell'obiettivo mostravano i conigli. Se un coniglio non mostrava un particolare passaggio, il custode dell'animale veniva istruito a tornare al passaggio precedente del protocollo.

Tutti i conigli tranne il coniglio #4 hanno eseguito i comportamenti obiettivo "pesatura", "ingresso nella scatola di trasporto" e "allevamento" (dati forniti come mediana) rispettivamente dopo 1 sessione, 2 sessioni e 2 sessioni (Tabella 2). Il coniglio #4 non era disposto a mostrare alcun passo di questi comportamenti obiettivo.

Otto animali su dieci che sono stati in grado di mostrare il passo finale del "salto in grembo" (9,9) hanno dimostrato questo comportamento dopo 3 sessioni (mediana). Sebbene i conigli #3 e #11 avessero precedentemente imparato il passaggio finale del "salto in grembo" (9.9), hanno mostrato solo il passaggio 9.3 con il custode dell'animale. I conigli #4, #7 e #10 hanno mostrato lo stesso passo del trainer (9.2, 9.3+ e 9.3).

Prestazioni dei comportamenti obiettivo dopo 1 settimana di pausa di allenamento

Per verificare se gli animali potessero mantenere le fasi finali di "pesatura", "ingresso nella scatola di trasporto", "allevamento" e "salto in grembo", l'addestratore ha recuperato i comportamenti obiettivo una settimana e due settimane dopo le sessioni di generalizzazione (Figura 1). Durante queste pause, gli animali non sono stati addestrati e non hanno ricevuto alcuna ricompensa.

In entrambi i momenti, tutti i conigli sono stati in grado di eseguire le fasi finali di "pesatura" (6,5), "ingresso nella scatola di trasporto" (7,6) e "allevamento" (8,3) che hanno imparato nel precedente addestramento di 3 settimane. Gli animali (n = 10) che hanno imparato il passaggio finale del "salto in grembo" (9,9) hanno mostrato questo comportamento in entrambi i punti temporali; Coloro che non hanno imparato il passo finale di questo comportamento obiettivo (n = 3) sono stati in grado di dimostrare l'ultimo passo che avevano raggiunto in precedenza (coniglio #4: passo 9.2; coniglio #7: passo 9.3+, coniglio #10: passo 9.3) dopo la prima pausa di 1 settimana. Dopo la seconda pausa di 1 settimana, questi tre conigli hanno mostrato gli stessi passi della settimana precedente, ma è stato anche chiesto di eseguire i passaggi successivi e hanno raggiunto il passaggio 9.9.

Esecuzione dei comportamenti obiettivo dopo una pausa di allenamento di circa 8,5 settimane

Dopo che gli animali hanno avuto una pausa di addestramento di circa 7,5 settimane (#1-5, #13) o 9,5 settimane (#6-12), i comportamenti obiettivo sono stati nuovamente richiamati. Tutti gli animali sono stati in grado di mostrare la fase finale di "pesatura" (6,5), "ingresso nella scatola di trasporto" (7,6) e "allevamento" (8,3). Dodici conigli hanno mostrato il passo finale del "salto in grembo" (9.9) mentre il coniglio #7 ha solo posizionato le zampe anteriori sulle gambe dell'addestratore e si è allungato in avanti per toccare il bersaglio con il naso/bocca (9.3).

Approccio volontario nei confronti del formatore familiare e di una persona sconosciuta

Tre settimane dopo l'addestramento, è stato testato il comportamento di approccio volontario dei conigli per indagare sulla loro interazione con l'addestratore familiare e una persona sconosciuta (entrambe femmine). Prima del test, entrambe le persone hanno fatto la doccia usando lo stesso gel doccia e shampoo, indossando lo stesso tipo di vestiti e dispositivi di protezione (guanti, mascherine, retine per capelli). Sono state eseguite due prove di 5 minuti con una pausa di 2 minuti tra le prove nel recinto degli animali. Come mostrato nella Figura 4A, l'allenatore familiare e una persona sconosciuta sedevano (nella stessa posizione) l'uno di fronte all'altro sul pavimento del recinto, con la parte posteriore rivolta verso la parete del recinto. Due case sono state rimosse dal recinto; la casa rimanente e il tunnel erano posti vicino alle altre due pareti alla stessa distanza da entrambe le persone. Nel 2^° tentativo, hanno scambiato le posizioni dei loro posti per considerare le potenziali preferenze di posizione dei conigli. Non si sono mossi né hanno parlato durante le prove di 5 minuti. Se un coniglio masticava i loro pantaloni e pizzicava la gamba, una mano veniva spostata delicatamente verso il coniglio per farlo fermare. Va notato che le osservazioni dei singoli animali sono state fatte all'interno del gruppo, cioè i conigli potevano interagire tra loro durante entrambe le prove.

I video sono stati analizzati retrospettivamente utilizzando BORIS⁵³. Secondo l'etogramma definito per questa indagine, un coniglio interagiva con una persona quando tutte e quattro le zampe erano nel quadrato di 70 cm × 70 cm attorno a una persona o sulla linea di confine di questo quadrato. Inoltre, è stato monitorato se un coniglio metteva entrambe le zampe anteriori sulle zampe o saltava in grembo (con tutte e quattro le zampe posizionate in grembo).

La Figura 4B mostra la durata dell'interazione dei conigli con le due persone. Il test di Wilcoxon ha rivelato che il tempo di interazione con l'addestratore e la persona sconosciuta differiva significativamente nel 1^{° studio (} z = -2,040, p = 0,041, coefficiente di correlazione di Pearson r = 0,57) ma non nel 2^{° studio (} z = 0,245, p = 0,807, r = 0,07). Nella^{prima prova,} i conigli hanno trascorso più tempo a interagire con l'addestratore.

Tre (#1, #5, #6) e cinque (#1, #6, #7, #8, #12) conigli hanno posizionato le zampe anteriori sulle zampe dell'addestratore rispettivamente nella prova 1 e 2. Cinque animali sono saltati con tutte e quattro le zampe in grembo all'addestratore (prova 1: #1, #3, #5, #6; prova 2: #9). Mentre quattro animali (#1, #2, #8, #9) nella^{prima prova e} tre (#1, #4, #8) animali nella^{seconda prova si} sono arrampicati con le zampe anteriori sulle gambe della persona sconosciuta, nessuno di loro è saltato con tutte e quattro le zampe in grembo. La media delle differenze tra il numero di "tocchi zampe anteriori-gambe" non differiva significativamente tra l'allenatore e la persona sconosciuta nella prova 1 (z = -0,264, p = 0,792, r = 0,07) né nella prova 2 (z = -0,707, p = 480, r = 0,20).

Effetto delle tecniche di manipolazione sul comportamento dei conigli nei confronti del "dispositivo di manipolazione"

Per indagare se le tecniche utilizzate per sollevare i conigli dal pavimento influenzassero il loro comportamento, dopo questa procedura è stata eseguita un'osservazione comportamentale di 2 minuti nel contesto dell'esame generale per due giorni consecutivi (Figura 1). Questa osservazione è stata effettuata per sette animali.

Il giorno 1, i conigli sono stati raccolti con la scatola di trasporto. Per questo, hanno seguito il bastone bersaglio nella scatola, la scatola è stata chiusa e portata al lettino da visita, come descritto nella fase di addestramento 7.5. Qui sono stati sollevati delicatamente dalla scatola al tavolo, con entrambe le mani / braccia poste sotto / intorno al corpo dell'animale. È stata effettuata un'ispezione sanitaria (compresa la palpazione del corpo, l'ispezione visiva di orecchie, occhi, narici, incisivi, regione anogenitale) e successivamente è stata offerta loro una ricompensa alimentare. Dopo l'ispezione sanitaria, sono stati guidati delicatamente con le mani nella scatola di trasporto. Il bastone bersaglio non è stato utilizzato sul lettino da visita per garantire che le mani dell'addestratore fossero libere per fissare gli animali. Quando i conigli sono entrati di nuovo nella scatola di trasporto e la porta è stata chiusa, la scatola è stata trasferita nel recinto e la porta è stata aperta. Il coniglio è stato fatto seguire il bastone bersaglio e lasciare la scatola, seguito dalla presentazione della ricompensa alimentare, come descritto nella fase di addestramento 7.6.

Il giorno 2, i conigli sono stati raccolti con la tecnica convenzionale, abitualmente utilizzata dai custodi degli animali (cioè, sono stati trattenuti per la collottola con una mano e brevemente sollevati sull'altro braccio con la testa rivolta verso l'incavo del braccio). Quindi sono stati trasferiti sul lettino da visita ed è stata eseguita un'ispezione sanitaria, come descritto sopra. Dopo l'ispezione sanitaria, è stata offerta loro una ricompensa alimentare dalla ciotola della ricompensa. Alla fine, sono stati di nuovo trattenuti per la collottola e brevemente sollevati sul braccio per riportarli al recinto. Dopo essere stati rilasciati, è stata offerta loro di nuovo una ricompensa in cibo.

Dopo che la ricompensa alimentare è stata offerta ai conigli nel recinto, l'addestratore si è seduto sul pavimento del recinto senza interagire con i conigli ed è stato registrato un video di 2 minuti, che è stato analizzato retrospettivamente utilizzando BORIS⁵³. Va notato che le osservazioni dei singoli animali sono state fatte all'interno del gruppo perché dovrebbero essere monitorate nel loro ambiente familiare. Ciò significa che i conigli potrebbero interagire tra loro. Sono stati studiati e definiti i seguenti parametri: Tempo di interazione con l'addestratore o la scatola di trasporto (cioè, un coniglio era nella zona di interazione dell'addestratore o della scatola di trasporto quando il naso era a meno di una lunghezza del corpo di distanza dall'addestratore o dalla scatola); durata del tempo trascorso nel trasportino (cioè, questo evento si è verificato quando l'animale si trovava nella zona di interazione del box; è iniziato quando i conigli sono entrati nel box con tutte e quattro le zampe e si è fermato quando una o più zampe sono state posizionate fuori dal box); durata del tempo trascorso a mangiare (ad esempio, il coniglio ha ingerito paglia, fieno, pellet o feci; masticare i vestiti o le scarpe dell'addestratore non è stato considerato mangiare); durata del tempo trascorso a nascondersi (questo evento è iniziato quando il coniglio è entrato in una casa o in un tunnel con tutte e quattro le zampe; si è fermato quando il coniglio ha lasciato il rifugio con una o più zampe); saltare in grembo (cioè, il coniglio è saltato in grembo all'addestratore e vi ha messo tutte e quattro le zampe; questo evento si è verificato quando l'animale era nella zona di interazione dell'addestratore); posizionare le zampe anteriori sulle zampe (cioè, il coniglio ha posizionato entrambe le zampe anteriori sulle zampe dell'addestratore; questo evento si è verificato quando l'animale si trovava nella zona di interazione dell'addestratore).

L'analisi comportamentale è stata eseguita dal formatore e da una persona completamente cieca alla procedura eseguita. Secondo Landis e Koch⁵⁴, l'affidabilità dell'interrottore tra l'addestratore e la persona cieca calcolata utilizzando BORIS⁵³ (Cohens Kappa) era sostanziale o quasi perfetta. Per ulteriori analisi, sono stati utilizzati i dati estratti dall'osservatore in cieco.

Il test di Wilcoxon ha rivelato che la tecnica di manipolazione convenzionale ha ridotto significativamente la durata dell'interazione con il "dispositivo di manipolazione", cioè la somma della durata del tempo trascorso interagendo con l'addestratore e la scatola dopo essere stato raccolto (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,89; Figura 5A). La tecnica di manipolazione non ha influenzato significativamente la durata dell'interazione con il trainer (z = 1,014, p = 0,310, r = 0,28; Figura 5B). Al contrario, prendere i conigli dalla scatola aumentava la durata della loro interazione con la scatola (z = 2,366, p = 0,018, r = 0,66; Figura 5C) e spesi nella scatola (z = 2,201, p = 0,028, r = 0,61; Figura 5D) rispetto alla tecnica di manipolazione convenzionale. Inoltre, gli animali hanno trascorso più tempo a nascondersi nei rifugi dopo essere stati raccolti con la tecnica di manipolazione convenzionale (z = -1,992, p = 0,046, r = 0,046; Figura 5F).

La tecnica di manipolazione non ha avuto alcun effetto significativo sulla durata del tempo che gli animali hanno trascorso a mangiare (z = 0,944, p = 0,345, r = 0,26; Figura 5E), il numero di conigli che mettono le zampe anteriori sulle zampe dell'addestratore (McNemar: p = 1,000) o saltano in grembo all'addestratore (McNemar: p = 0,500). Indipendentemente dalla tecnica di manipolazione, il coniglio #9 è saltato in grembo all'addestratore e il coniglio #12 ha posizionato le zampe anteriori sulle zampe dell'addestratore. Inoltre, i conigli #8 e #11 mettono le zampe anteriori sulle zampe dopo essere stati raccolti dalla scatola di trasporto.

Mentre la ricompensa alimentare offerta sul lettino da visita è stata ingerita da tutti i conigli dopo il breve trasporto nella scatola, solo un coniglio (#8) l'ha accettata dopo la tecnica di manipolazione convenzionale. Questa differenza era significativa (McNemar: p = 0,031). Nel recinto, la ricompensa in cibo è stata accettata da sei conigli (cioè tutti tranne il #7) dopo aver lasciato la scatola di trasporto e quattro conigli (#7, #9, #10 e #12) dopo essere stati rilasciati dal braccio (tecnica di manipolazione convenzionale; McNemar: p = 0,625).

Figura 1: Pianificazione oraria. Tutte le sessioni di assuefazione, addestramento e generalizzazione, nonché le osservazioni comportamentali, sono state effettuate al mattino prima dell'alimentazione e della pulizia. Nella settimana 1 (cioè quattro giorni dopo l'arrivo), cinque sessioni di condizionamento/assuefazione contestuale (dal lunedì al venerdì; sezione 3 del protocollo) sono state effettuate dai custodi degli animali e dall'autore corrispondente (tutte femmine), seguite da un periodo di addestramento di 3 settimane nelle settimane 2-4 (dal lunedì al venerdì; sezione del protocollo 4-9). Le sessioni di formazione sono state condotte dall'autore corrispondente, un veterinario specializzato in scienze degli animali da laboratorio ed esperto nell'addestramento di conigli, topi, polli e cavalli. Successivamente, sono state effettuate osservazioni comportamentali per due giorni consecutivi per indagare se la tecnica utilizzata per sollevare i conigli dal pavimento influisse sul loro comportamento. Nella settimana 5, sono state condotte cinque sessioni di generalizzazione (dal lunedì al venerdì) per valutare se i conigli avrebbero eseguito i comportamenti dell'obiettivo appresi con un'altra persona rispetto all'addestratore. Nella settimana 6 e nella settimana 7 (il giovedì) e nella settimana 14 (lunedì/martedì), l'addestratore ha testato nel contesto dell'ispezione sanitaria generale settimanale se i conigli potevano mantenere e mostrare i comportamenti obiettivo. Un test di approccio volontario con l'addestratore e una persona sconosciuta è stato effettuato nella settimana 7 per studiare le risposte comportamentali dei conigli nei confronti di esseri umani familiari rispetto a quelli sconosciuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Arena di allenamento. L'arena di addestramento (vedi Tabella dei materiali) è stata allestita pochi minuti prima dell'inizio dell'addestramento. (A) Per facilitare il trasporto e l'installazione, l'arena era composta da due pezzi, che erano collegati tra loro nel recinto. (B) Due file di pannelli di plastica trasparente hanno creato un'arena di circa 136 cm × 90 cm × 70 cm. La porta era fissata agli altri pannelli tramite fascette che permettevano di aprirla e chiuderla. La porta può essere bloccata tramite una clip. Poiché le pareti dell'arena di allenamento erano trasparenti, un coniglio aveva un contatto visivo, olfattivo e acustico con i membri del gruppo quando entrava nell'arena di addestramento. Uno sgabello/gradino basso come sedile per l'allenatore e, a seconda del comportamento obiettivo da allenare, una bilancia o una scatola di trasporto possono essere posizionati nell'arena. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Ciotola di ricompensa con clicker integrato. La ciotola della ricompensa è stata stampata in 3D utilizzando acido polilattico bianco (PLA). Dimensioni della ciotola quadrata: 8 cm × 8 cm × 3 cm; Dimensioni del manico cilindrico: 9,5 cm × 2,3 cm. Un clic con le dita (vedi Tabella dei materiali) era attaccato all'impugnatura. Un file di stampa 3D per la ciotola della ricompensa può essere trovato nel file di codifica supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Test di avvicinamento volontario. (A) Nelle due prove di 5 minuti, l'addestratore familiare e una persona di sesso femminile sconosciuta si sono seduti l'uno di fronte all'altro nel recinto, con la schiena rivolta verso la parete del recinto. Una casa e un tunnel sono stati collocati vicino alle altre due pareti alla stessa distanza da entrambe le persone. (B) La durata del tempo trascorso interagendo con una persona è stata analizzata per ogni coniglio. Un coniglio interagiva con una persona quando tutte e quattro le zampe erano nel quadrato di 70 cm × 70 cm attorno a una persona o sulla linea di confine di questo quadrato. I simboli indicano i dati di ogni singolo animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Effetti delle tecniche di manipolazione sul comportamento dei conigli. (A-F) Illustrazioni dei dati comportamentali raccolti da sette conigli dopo che sono stati maneggiati dalla scatola di trasporto o dalla tecnica convenzionale (cioè, sono stati trattenuti dalla collottola e sollevati sul braccio). Poiché il trainer e la scatola di trasporto sono stati considerati come "dispositivi di movimentazione", (A) Questo pannello mostra la somma dei pannelli B e C. I simboli indicano i dati di ogni singolo animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Coniglio	Numero di sessioni di allenamento necessarie per allenare il comportamento dell'obiettivo
	Seguire l'obiettivo	Pesatura	Inserimento della scatola di trasporto	Allevamento	Saltare in grembo
#1	1	1	2	2	2
#2	1	1	4	1	5
#3	2	1	3	1	4
#4	7	2	1	3	2 (passaggio 9.2)
#5	2	1	3	1	3
#6	2	1	2	1	1
#7	8	1	2	2	3 (passaggio 9.3+)
#8	2	1	2	1	1
#9	2	1	2	1	2
#10	2	2	3	3	5 (passaggio 9.3)
#11	2	1	2	2	4
#12	2	1	1	1	1
#13	2	3	1	2	4
Mediana (25°-75° percentile)	2	1	2	1	2.5
	(2–2)	(1–1.5)	(1.5–3)	(1–2)	(1–4)*

Tabella 1: Numero di sessioni necessarie per addestrare i comportamenti obiettivo. Se un coniglio non ha imparato la fase finale di un comportamento obiettivo, l'ultima fase di addestramento raggiunta è indicata tra parentesi.

Definizione di una sessione di allenamento: circa 30 minuti per gruppo (6-7 animali); Dal lunedì al venerdì per tre settimane; inizia quando il formatore si siede nel recinto ed è pronto per iniziare l'allenamento; termina quando nessuno dei conigli partecipa più all'addestramento o tutti i conigli hanno raggiunto un passo finale di un comportamento obiettivo; Un animale può eseguire più di una prova per sessione.

* I conigli #4, #7, #10 sono stati esclusi da questo calcolo poiché non hanno raggiunto la fase finale del "salto in grembo".

Coniglio	Numero di sessioni di allenamento fino al raggiungimento della fase finale del comportamento obiettivo
	Pesatura (5 fasi di allenamento)	Inserimento della casella di trasporto (6 fasi di allenamento)	Allevamento (3 fasi di addestramento)	Salto in grembo (9 fasi di allenamento)
#1	1	3	1	1
#2	1	3	1	1
#3	1	3	1	F (9.3)
#4	F	F	F	3 (9.2)
#5	2	3	2	2
#6	1	1	3	3
#7	1	1	3	3 (9.3+)
#8	1	1	1	3
#9	1	1	1	3
#10	1	3	3	3 (9.3)
#11	1	1	3	F (9.3)
#12	1	1	3	3
#13	1	3	2	5
Mediana (25°-75° percentile)	1	2	2	3
	(1–1)	(1–3)	(1–3)	(1.25–3)
	(escluso #4)	(escluso #4)	(escluso #4)	(esclusi #3, #4, #7, #10, #11)

Tabella 2: Generalizzazione. In cinque sessioni (dal lunedì al venerdì), un custode di animali familiare ai conigli ha chiesto ai conigli di eseguire i passaggi finali (o l'ultimo passo raggiunto) dei comportamenti obiettivo addestrati. Se la fase finale di un comportamento obiettivo non è stata raggiunta, l'ultima fase di allenamento raggiunta è indicata tra parentesi. F (fallimento) è stato indicato quando un animale non ha mostrato l'ultimo passo di un comportamento obiettivo precedentemente raggiunto nell'addestramento. Definizione di sessione: dal lunedì al venerdì per una settimana; inizia quando il custode e l'addestratore dell'animale si siedono nel recinto; termina quando nessuno dei conigli partecipa (più) o tutti i conigli hanno mostrato il passo finale (o l'ultimo passo raggiunto) di un comportamento obiettivo desiderato; Un animale può eseguire più di una prova per sessione.

File di codifica supplementare 1: file di stampa 3D "ciotola di ricompensa". L'acido polilattico (PLA) può essere utilizzato per la stampa. Fare clic qui per scaricare questo file.

Scheda supplementare 1: Foglio di documentazione per sei conigli. Il foglio deve essere stampato o aperto su un tablet per documentare i progressi dell'addestramento di ogni coniglio. In ogni sessione di addestramento, è necessario annotare quali fasi di addestramento hanno raggiunto i singoli animali o se sono stati necessari adattamenti al protocollo. Devono essere documentati anche eventuali eventi speciali (ad es. fattori esterni, stato di salute alterato). Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Protocolli di allenamento semplificati. Le tabelle descrivono i passaggi delle sezioni del protocollo 3-9 in modo semplificato. Per ulteriori dettagli, si dovrebbero leggere le fasi del protocollo del manoscritto principale. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

I protocolli di addestramento sono stati sviluppati per perfezionare le procedure di routine come la manipolazione, le ispezioni sanitarie e la pesatura nei conigli da laboratorio. La loro fattibilità è stata valutata in questo studio esplorativo utilizzando tredici femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda. I protocolli di addestramento potrebbero essere applicati in modo affidabile per addestrare con successo i conigli. La maggior parte dei conigli è stata in grado di apprendere i comportamenti obiettivo definiti nei protocolli di addestramento entro meno del periodo di addestramento di 3 settimane, li ha ricordati dopo 1 settimana di pausa di addestramento e li ha generalizzati a un'altra persona rispetto all'addestratore. Pochi adattamenti al protocollo hanno dovuto essere apportati per soddisfare le esigenze dei singoli animali. Il risultato principale del presente studio è stato che la tecnica di manipolazione raffinata per raccogliere i conigli, come descritto nei protocolli di addestramento, era meno avversiva della tecnica di manipolazione convenzionale. È interessante notare che i conigli addestrati hanno mostrato il loro comportamento esplorativo non solo nei confronti dell'addestratore familiare, ma anche di una persona sconosciuta in un test di approccio volontario.

Significato del target

L'obiettivo è servito come base per il presente protocollo di formazione. Quando hanno introdotto il bersaglio, gli animali hanno imparato che il loro comportamento ha influenzato l'ambiente e ha generato conseguenze. L'introduzione del bersaglio crea fiducia tra l'uomo e l'animale, come dimostrato dal coniglio #4, ci sono volute 7 sessioni di allenamento prima di seguire il bastone del bersaglio nell'arena di addestramento, ma ha imparato rapidamente i seguenti comportamenti obiettivo (cioè entro 1-3 sessioni di addestramento). Questo coniglio #4 sembrava aver guadagnato fiducia nell'addestratore durante l'introduzione del bersaglio, il che ha facilitato l'addestramento degli altri comportamenti obiettivo. Tuttavia, questo coniglio mancava ancora di fiducia nelle altre persone e non era disposto a mostrare la maggior parte dei comportamenti obiettivo nelle sessioni di generalizzazione.

Va notato che la destinazione non è stata definita come endpoint in alcune sezioni del protocollo. Invece, ad esempio, gli animali dovevano seguire il bersaglio per un numero variabile di salti o rimanere sulla bilancia per un numero variabile di secondi. È stato scelto un modello di ricompensa variabile per aumentare e mantenere l'attenzione e la motivazione dei conigli durante l'addestramento.

Segnali

Dopo che i conigli avevano eseguito con successo il passaggio 5.1, in tutte le sessioni di addestramento successive, l'addestratore ha posizionato il bersaglio a distanza ravvicinata dal naso del coniglio per segnalare al coniglio che la prova di addestramento era iniziata. Se il coniglio toccava il bersaglio con il naso/bocca, veniva presa in considerazione la volontà di partecipare all'addestramento e iniziava l'addestramento.

I protocolli attuali non includevano ulteriori segnali, ad esempio, la bilancia, la scatola di trasporto o la mano non erano considerati segnali. Invece, il bersaglio è stato utilizzato per condurre l'animale nell'arena di addestramento, sulla bilancia, nella scatola di trasporto, in aria (allevamento) o in grembo all'addestratore. Ciò significa che i comportamenti obiettivo "pesare", "entrare nella scatola di trasporto", "impennarsi" e "saltare in grembo" erano modifiche di "seguire il bersaglio". La ragione di ciò erano i requisiti per il protocollo di addestramento: doveva essere fattibile per essere svolto dal personale delle strutture per animali, che potrebbe non essere esperto nell'addestramento degli animali, e facilmente integrabile nella routine lavorativa quotidiana. Pertanto, i protocolli devono essere efficienti e raggiungere rapidamente i comportamenti degli obiettivi.

Tuttavia, anche la mano che viene posta davanti al coniglio (passaggio 8.3), la bilancia o la scatola di trasporto hanno il potenziale per diventare sia un segnale che un bersaglio per le zampe. Pertanto, potrebbe essere possibile definire ulteriori passaggi che vanno oltre gli attuali protocolli e non richiedono l'uso del target stick. Ad esempio, non appena il coniglio vede la squama, la squama segnala ai conigli di saltarci sopra con tutte e quattro le zampe.

Adattamenti dei protocolli

Sebbene ci si possa aspettare che il fenotipo di animali da laboratorio quasi geneticamente identici sia molto simile, ci sono "differenze comportamentali tra gli individui che sono coerenti nel tempo e tra le situazioni [e] sono indicate come personalità"⁵⁵, ad esempio, alcuni animali sono piuttosto timidi e altri audaci⁵⁶. Gli animali timidi e meno esplorativi potrebbero impiegare più tempo per apprendere i comportamenti obiettivo definiti del protocollo (ad esempio, coniglio #4). Anche se i protocolli di addestramento standard possono essere adatti alla maggior parte delle persone, l'addestramento deve considerare le esigenze di un singolo animale e adattarsi ad esse, quando necessario²⁶. Pertanto, dovrebbero essere definiti ulteriori passaggi intermedi più piccoli per quei conigli che non riescono ad apprendere una fase di addestramento del protocollo. Le ulteriori fasi di formazione intermedia dovrebbero aiutarli a procedere con successo verso la fase successiva. Soprattutto perché i piani di allenamento sono sviluppati in teoria e poi testati nella pratica, può diventare evidente che sono necessari ulteriori passaggi di allenamento per allenare un particolare comportamento obiettivo.

Rispetto agli attuali protocolli di addestramento, è stato necessario aggiungere alcune fasi intermedie di addestramento per i comportamenti obiettivo "seguire il bersaglio", "entrare nella scatola di trasporto", "impennarsi" e "saltare in grembo", come descritto in dettaglio nella sezione sui risultati rappresentativi poiché i singoli animali non sono riusciti a proseguire con la fase di addestramento successiva. È interessante notare che i passaggi intermedi 8.2+ e 9.3+ sono stati richiesti dalla maggior parte dei conigli, sottolineando la loro importanza. Pertanto, questi passaggi sono stati aggiunti come nota ai protocolli di allenamento.

In alternativa, al passo definito 8.2+, l'addestratore potrebbe appoggiare una mano sul pavimento con il palmo rivolto verso l'alto e lasciare che il coniglio calpesti la mano con una ed eventualmente entrambe le zampe anteriori. Inoltre, è concepibile che un coniglio richieda ulteriori passaggi intermedi prima del passaggio 9.3+, ad esempio, prima il coniglio posiziona una zampa posteriore e poi entrambe le zampe posteriori in grembo all'addestratore. Se un coniglio non accetta di essere toccato nei passaggi 9.5-9.9, la durata del contatto con le diverse parti del corpo potrebbe essere gradualmente aumentata. Inoltre, inizialmente solo l'indice e il medio potevano essere usati per accarezzare gli animali con una pressione leggera come una piuma. Quindi il numero di dita utilizzate per il contatto e la pressione possono essere aumentati in più fasi.

Affinamento delle tecniche di manipolazione

Si può presumere che la manipolazione sia altamente avversiva, specialmente nei conigli con un tratto di personalità timido. I conigli sono animali da preda terrestri e il fatto di essere sollevati (cioè sollevati dal pavimento) o trattenuti (cioè tenuti tra le braccia di un essere umano) per un'ispezione sanitaria e una procedura sperimentale è probabile che causi ansia e angoscia. Un'opzione per perfezionare i metodi di manipolazione è stata introdotta nei protocolli di addestramento: invece di trattenere il coniglio per la collottola e sollevare il coniglio sull'altro braccio, il coniglio può essere condotto con il bastone bersaglio nella scatola e portato nella scatola al lettino da visita, come suggerito in precedenza^{50, 57}, dove il coniglio viene trasferito delicatamente dalla scatola al tavolo. In alternativa, la parte superiore della scatola può essere rimossa o il coniglio può essere guidato con il bastoncino bersaglio fuori dalla scatola.

Le osservazioni comportamentali eseguite dopo che i conigli sono stati prelevati utilizzando la tecnica di manipolazione convenzionale o la scatola di trasporto hanno rivelato che la tecnica di manipolazione convenzionale era associata a comportamenti più legati allo stress e all'ansia rispetto alla tecnica alternativa. Questa conclusione è stata tratta dall'elevato numero di animali che rifiutavano la ricompensa alimentare sul lettino da visita e dall'aumento della durata del tempo trascorso a nascondersi nei rifugi quando veniva applicata la tecnica di manipolazione convenzionale. È interessante notare che la tecnica di manipolazione non ha influenzato il tempo di interazione con l'addestratore, indicando che il processo di manipolazione potrebbe non aver compromesso la relazione uomo-animale. Tuttavia, oltre al trainer, la scatola di trasporto serviva anche come "dispositivo di manipolazione" (cioè, il dispositivo di manipolazione della tecnica convenzionale era il trainer, i dispositivi di manipolazione della tecnica alternativa erano sia il trainer che la scatola di trasporto). Pertanto, è stato analizzato anche il tempo di interazione con la scatola di trasporto. Sebbene i conigli fossero appena stati raccolti con la scatola di trasporto, trascorrevano più tempo a interagire con la scatola o nella scatola rispetto a quando venivano raccolti con la tecnica convenzionale. Ciò ha suggerito che la scatola di trasporto potrebbe essere associata a un effetto positivo. Confrontando la durata dell'interazione con entrambi i "dispositivi di manipolazione" (cioè la somma del tempo trascorso interagendo con la scatola e l'addestratore), la tecnica di manipolazione della scatola ha aumentato la durata dell'interazione con i "dispositivi di manipolazione", cioè questa tecnica ha avuto un chiaro effetto positivo sulla risposta comportamentale dei conigli nei confronti dei "dispositivi di manipolazione" in previsione di essere maneggiati. Risultati simili sono stati fatti nei topi di laboratorio, dimostrando che le tecniche di manipolazione delicata e l'addestramento hanno ridotto lo stress e l'ansia: gli animali che sono stati raccolti usando un tunnel o le mani a coppa hanno trascorso più tempo a interagire volontariamente con il "dispositivo di manipolazione" e hanno mostrato meno comportamenti legati all'ansia rispetto ai topi con il manico della coda¹². L'allenamento sembrava rafforzare questo effetto. Leidinger et al. hanno dimostrato che i topi con manico delicato (tunnel/coppa) hanno mostrato meno minzione, defecazione e vocalizzazione quando sono stati trattenuti dalla collottola e meno comportamento fluttuante nel Morris Water Maze Test quando sono stati addestrati con PRT rispetto ai topi non addestrati¹³.

Fattibilità dei protocolli per il lavoro quotidiano - durata, fidelizzazione e generalizzazione della formazione

Il numero di sessioni di addestramento necessarie per apprendere un comportamento obiettivo dipendeva dal singolo animale e dai comportamenti obiettivo, che comprendevano un diverso numero di passaggi che andavano dalla sezione 3 alla sezione 9 del protocollo presentato sopra.

A seconda del numero di animali che sono riusciti ad apprendere un comportamento obiettivo e del numero di adattamenti che hanno dovuto essere apportati ai protocolli per i singoli animali, le fasi di addestramento avevano diversi livelli di difficoltà. Il comportamento "seguire il bersaglio" è stata la prima esperienza di addestramento dei conigli e, quindi, alcuni animali hanno impiegato più tempo per addestrarsi su questo comportamento rispetto all'altro comportamento obiettivo, come discusso sopra. Mentre tutti gli animali potevano essere addestrati alla "pesatura" secondo il presente protocollo, erano necessari ulteriori passaggi intermedi per "entrare nella scatola di trasporto" da parte di due animali e per "allevare" e "saltare in grembo" da quasi tutti i conigli. Ciò può essere spiegato dal grado di contatto fisico tra animale e addestratore che era necessario per eseguire i diversi comportamenti obiettivo. "Pesare" ed "entrare nella scatola di trasporto" non comportavano alcun contatto fisico tra animale e uomo. La fase finale di "allevamento" (8.3) e le fasi 9.2-9.4 di "salto in grembo" richiedevano ai conigli di entrare in contatto fisico con l'addestratore. Inoltre, l'addestratore ha toccato la spalla, la schiena, la groppa, le orecchie o le zampe del coniglio nei passaggi 9,5-9,9 di "salto in grembo", aumentando il grado di contatto fisico tra animale e addestratore. Accettare di essere toccati è stato più difficile per alcuni conigli che per altri. Come discusso in precedenza, è stato utile adattare i protocolli di addestramento di questi comportamenti obiettivo e aggiungere passaggi intermedi.

Tuttavia, tre conigli hanno richiesto sessioni di addestramento aggiuntive per completare il comportamento obiettivo "saltare in grembo" (#4, #7, #10). Si potrebbero escludere menomazioni fisiche che impedivano a questi animali di saltare in grembo all'addestratore. Inoltre, i conigli erano in grado di saltare sulle loro case, le altezze di queste erano più alte del grembo dell'addestratore.

È stato evidente che due di questi tre conigli (#4 e #10) hanno avuto bisogno di più tempo per abituarsi all'addestratore e alla ricompensa alimentare nelle sessioni di assuefazione e in parte hanno avuto bisogno di più sessioni di allenamento per raggiungere la fase finale di altri comportamenti obiettivo. Questo è stato vero anche per il coniglio #7, che ha avuto un infortunio alla coda a causa di risse all'interno del gruppo dalla quarta sessione di assuefazione. Pertanto, il coniglio #7 è stato raccolto, trasferito sul lettino da visita, trattato e ispezionato quotidianamente per 15 giorni, il che potrebbe aver comportato una maggiore cautela nei confronti degli esseri umani. Da un lato, è fondamentale notare che le prestazioni di allenamento possono essere influenzate, ad esempio, da uno stato di salute alterato, da un aumento dei livelli di stress o da una relazione uomo-animale disturbata a causa di altri interventi. D'altra parte, queste osservazioni hanno dimostrato l'importanza dell'assuefazione per l'allenatore e la ricompensa alimentare. Alcuni animali potrebbero richiedere più tempo per familiarizzare con la presenza dell'addestratore e accettare la ricompensa alimentare dall'addestratore. Se fossero state condotte ulteriori sessioni di assuefazione, i conigli #4 e #10 avrebbero potuto ottenere risultati migliori nelle sessioni di addestramento. L'importanza di abituare i conigli all'uomo è già stata riportata in letteratura. L'allevatore commerciale, da cui sono stati acquistati i conigli utilizzati in questo studio, ha recentemente introdotto sessioni regolari di accarezzamento, che hanno ridotto il comportamento correlato allo stress ed eliminato le aggressioni⁵⁸. In uno studio precedente, è stato dimostrato che accarezzare e maneggiare i giovani conigli riduce il comportamento correlato all'ansia, aumenta il loro aumento di peso e riduce il tasso di mortalità⁵⁹.

Una volta che i conigli hanno appreso i diversi comportamenti obiettivo, sono stati ancora in grado di mostrarli dopo due brevi (una settimana) e una lunga (circa 7,5-9,5 settimane) pause di addestramento, salvo eccezioni individuali. Queste osservazioni possono indicare che è sufficiente chiedere ai conigli di eseguire i comportamenti dell'obiettivo addestrato una volta alla settimana quando viene eseguito l'esame generale e la stanza/recinto viene pulita.

Per la fattibilità del protocollo per la vita lavorativa quotidiana, è anche fondamentale che i conigli generalizzino i comportamenti degli obiettivi addestrati a persone diverse dall'addestratore. In caso di vacanza o malattia, un'altra persona deve continuare l'addestramento e la cura degli animali. La maggior parte dei conigli (dodici su tredici) ha generalizzato i comportamenti obiettivo "pesare", "entrare nella scatola di trasporto" e "allevare" al custode dell'animale, anche se, in alcuni casi, i conigli hanno impiegato più di una sessione di addestramento per mostrare il comportamento desiderato. "Pesare" sembrava generalizzare meglio; seguito da "entrare nella scatola di trasporto" e "allevamento". Tuttavia, "saltare in grembo" sembrava essere più difficile da generalizzare a un'altra persona. Gli animali hanno impiegato più tempo per dimostrare il comportamento desiderato (9.9.) e due conigli, che in precedenza avevano imparato il passaggio finale 9.9, non sono riusciti a mostrare questo comportamento obiettivo, probabilmente a causa del maggiore contatto fisico necessario (vedi sopra). Un coniglio (#4) non ha mostrato alcun passaggio dei comportamenti obiettivo "pesatura", "ingresso nella scatola di trasporto" e "allevamento" e non era interessato a interagire con il custode dell'animale. Il coniglio #4 era uno degli animali che aveva bisogno di più tempo per abituarsi all'addestratore e alla ricompensa alimentare nelle sessioni di assuefazione. Ciò può indicare che, per alcuni individui, sono utili sessioni aggiuntive in cui i custodi degli animali trascorrono del tempo con i conigli, li abituano ad accettare la ricompensa alimentare da loro e costruiscono un legame positivo²³. I conigli possono essere in grado di distinguere tra persone diverse, come dimostrato per i ratti⁶⁰. Ulteriori fattori che hanno il potenziale per influenzare le prestazioni dei conigli nelle sessioni con l'addestratore e il custode degli animali possono essere segnali inconsci che l'addestratore ha dato agli animali durante le sessioni di addestramento, ad esempio la posizione del bastone bersaglio o della ciotola della ricompensa, la posizione o il movimento del corpo. Se l'addestratore non è a conoscenza di questi segnali, non saranno documentati e le altre persone non imiteranno questi segnali.

Inoltre, le capacità di addestramento delle persone che lavorano con gli animali, inclusa la routine di maneggiare il bastone bersaglio e la presentazione della ricompensa, possono influenzare il comportamento degli animali. Oltre alla conoscenza dei principi di apprendimento e della comunicazione animale, sono necessarie esperienze pratiche per addestrare con successo un animale⁶¹ e recuperare un comportamento obiettivo. Poiché le sessioni di generalizzazione che coinvolgono una persona qualificata e una non qualificata non sono state confrontate, la rilevanza del fattore "abilità di formazione" non può essere determinata. Tuttavia, per quanto ne sanno gli autori, gran parte del personale degli animali da laboratorio non è addestrato all'addestramento degli animali e quindi le condizioni in cui sono state eseguite le sessioni di generalizzazione (cioè, coinvolgendo un custode degli animali con solo poche esperienze precedenti nell'addestramento con i clicker) rappresentavano un ambiente realistico nelle strutture per animali da laboratorio.

I dati rappresentativi dei protocolli forniscono alle strutture animali un'idea del carico di lavoro associato all'addestramento dei diversi comportamenti obiettivo. I dati possono aiutare le strutture per animali a creare i propri orari di lavoro durante l'implementazione del protocollo. A seconda del singolo animale e dei comportamenti obiettivo, un po' di tempo aggiuntivo dovrebbe essere riservato al processo di generalizzazione. Tuttavia, la durata del tempo può variare quando si lavora con conigli maschi o un'altra razza di coniglio. Nelle strutture per animali, si dovrebbe discutere se esiste un tempo appropriato e cosa deve essere cambiato per consentire il tempo per l'addestramento degli animali.

Oltre al tempo necessario per l'addestramento degli animali, bisogna considerare che l'addestramento ha bisogno di addestratori qualificati e anche insegnare al personale come addestrare gli animali può richiedere molto tempo. Se la formazione fosse una parte obbligatoria della formazione del personale degli animali da laboratorio, cioè custodi degli animali, veterinari e ricercatori, l'implementazione della formazione degli animali nelle strutture sarebbe facilitata e richiederebbe meno tempo. Secondo l'allegato III della Direttiva 2010/63/UE, "gli stabilimenti devono istituire programmi di abituamento e addestramento adatti agli animali, alle procedure e alla durata del progetto", ovvero l'addestramento degli animali è richiesto dalla legge. In Germania, tali programmi devono essere presentati al momento della richiesta di una licenza per la sperimentazione animale. Ciò richiede che le persone che pianificano esperimenti sugli animali e lavorano con animali da laboratorio siano esperte nell'addestramento degli animali. Tuttavia, almeno in Germania, l'addestramento degli animali non fa parte del programma di formazione dei custodi degli animali nel campo della ricerca e della clinica 62,63,64. Inoltre, non è esplicitamente menzionato nel quadro dell'UE per l'istruzione e la formazione⁶⁵. Pertanto, finché la formazione non è stata implementata in questi regolamenti, lo sviluppo professionale continuo incentrato sulla formazione di rinforzo positivo richiede maggiore attenzione. Il personale degli animali da laboratorio deve apprendere i principi delle tecniche di apprendimento e addestramento, i criteri necessari, il trasferimento delle procedure tra gli addestratori, la tenuta dei registri e come rispondere agli animali che non partecipano nel modo desiderato per garantire coerenza e prevedibilità.

Interazione uomo-animale

L'intenso tempo di interazione uomo-animale durante le sessioni di addestramento fornisce un ambiente ottimale per rafforzare la relazione tra i singoli conigli e l'addestratore ^26,66. Una relazione uomo-animale positiva è benefica per il benessere degli animali poiché può ridurre i loro livelli di stress nell'allevamento e negli ambienti sperimentali⁶⁷. Negli attuali protocolli di addestramento, l'addestratore considera l'agenzia dei conigli e possono decidere di partecipare (o non partecipare) all'addestramento su base volontaria. Fornire agli animali un'azione è vantaggioso per il loro benessere ¹⁶ e dovrebbe quindi essere perseguito negli esperimenti così come nell'alloggio e nell'allevamento. Ci sono diversi livelli di agenzia comportamentale⁶⁸; la partecipazione al PRT può essere attribuita al livello di azione guidata, cioè "comportarsi attivamente per raggiungere i risultati attuali [ad esempio, procurarsi cibo]"⁶⁸.

Analizzando l'approccio volontario dei conigli nei confronti dell'addestratore e di una persona sconosciuta, si potrebbe osservare un'intensa interazione uomo-animale. I risultati hanno rivelato che tutti i conigli, ad eccezione di un animale nel 1^° studio (# 12), hanno interagito sia con l'addestratore che con la persona sconosciuta. Sembravano riconoscere l'allenatore poiché mostravano una chiara preferenza per l'interazione con l'allenatore nella^1a prova e alcuni di loro saltavano con tutte e quattro le zampe in grembo all'allenatore; un comportamento che non è stato mostrato nei confronti della persona sconosciuta. Sebbene i conigli abbiano trascorso più tempo a interagire con l'addestratore rispetto alla persona sconosciuta nel 1^° studio, il tempo di interazione non differiva più nel 2^° studio. Una ragione di questa osservazione potrebbe essere che i conigli si aspettavano di ricevere una ricompensa alimentare dall'addestratore nella 1a^{prova e} , a causa della mancanza di ricompense alimentari nel test di approccio volontario, non hanno più trascorso più tempo con l'addestratore nella^2a prova. Questi dati hanno tuttavia sottolineato che i conigli addestrati si sono rapidamente abituati alla presenza di una persona sconosciuta e nessuno di loro era troppo timido per interagire. Al contrario, erano molto esplorativi e interessati alla persona sconosciuta. Tuttavia, poiché non è stato studiato un gruppo di controllo non addestrato, l'effetto dell'addestramento sul comportamento di approccio volontario dei conigli non è chiaro.

Un'ipotesi che spiega il comportamento del coniglio #12 nel 1^{° studio è} che questo individuo doveva ancora abituarsi alla presenza della persona sconosciuta nel 1^° studio ed era più interessato a interagire sia con l'addestratore (70 secondi) che con la persona sconosciuta (9 secondi) nel 2^° studio. I conigli hanno diversi tratti della personalità che possono influenzare il livello di comfort con persone sconosciute e, a sua volta, la latenza di avvicinamento o la durata dell'interazione con una persona^69,70.

Limitazioni

Siamo consapevoli che tutti i conigli nel recinto/stanza, non solo quello che partecipa all'addestramento, possono sentire il clic (cioè il rinforzo condizionato) durante una sessione di addestramento e il suo effetto rinforzante può essere indebolito poiché la ricompensa alimentare (cioè il rinforzo naturale/incondizionato) non viene presentata. Se un coniglio fuori dall'arena di addestramento mostra un comportamento addestrato e sente il clic, ma non viene presentato cibo (e questo scenario si verifica più volte), il comportamento addestrato potrebbe essere estinto. Questo fenomeno è indicato come estinzione^64,71. Tuttavia, poiché tutti i comportamenti obiettivo degli attuali protocolli dipendono dall'obiettivo presentato dal formatore, è improbabile che si verifichi l'estinzione nel nostro ambiente di addestramento.

Poiché le pareti dell'arena di addestramento erano trasparenti e l'arena di addestramento si trovava nel recinto, i conigli potevano vedersi, ascoltarsi e annusarsi a vicenda durante l'addestramento, il che è un chiaro vantaggio legato al benessere. Inoltre, i conigli potrebbero aver osservato i membri del loro gruppo durante le sessioni di addestramento e aver imparato l'uno dall'altro. Nei ratti, è stato precedentemente dimostrato che gli individui hanno imparato a eseguire un comportamento obiettivo osservando il loro compagno di gabbia addestrato da PRT⁴⁵. Questo fatto può essere considerato sia un vantaggio che uno svantaggio. Il progresso dell'apprendimento degli animali può essere più veloce quando possono osservarsi a vicenda. Tuttavia, i dati dei singoli animali possono essere influenzati dalle prestazioni dei membri del gruppo e non possono essere attribuiti esclusivamente all'addestramento del singolo animale. Pertanto, l'addestramento degli animali senza alcun contatto con i membri del gruppo o con i conigli alloggiati da un solo alloggio potrebbe richiedere più tempo.

Le osservazioni comportamentali degli individui (nel test di approccio volontario e dopo aver applicato le diverse tecniche di manipolazione) sono state effettuate nel loro ambiente sociale familiare e nel gruppo per evitare lo stress e la distrazione causati da un nuovo ambiente e dalla separazione dal loro gruppo, che a sua volta avrebbe influenzato le osservazioni comportamentali. Lo svantaggio è, tuttavia, che i conigli potrebbero aver influenzato il comportamento reciproco durante le sessioni di osservazione.

Gli effetti delle tecniche di manipolazione sono stati studiati solo in sette animali che coinvolgono l'addestratore come persona che maneggia gli animali. Gli autori stanno pianificando uno studio di follow-up che includa un calcolo a priori della dimensione del campione per riprodurre i risultati con altri gestori e per esaminare ulteriormente le differenze tra le tecniche di manipolazione.

Tutti gli esseri umani coinvolti nell'addestramento, nella manipolazione e nel test di approccio volontario erano femmine. Non è stato studiato se le prestazioni di addestramento dei conigli o il loro comportamento varierebbero se fossero coinvolte persone di sesso maschile.

Gli attuali protocolli di addestramento dovrebbero dare al lettore un'idea di ciò che può essere addestrato nei conigli, ma non comprendono tutti i potenziali comportamenti obiettivo che sarebbero utili per addestrare in un coniglio da laboratorio. Ad esempio, anche la marcatura di un coniglio come suggerito nella sezione del protocollo sui requisiti generali varrebbe la pena di essere addestrata usando il PRT.

Come sottolineato più sopra, la scelta della giusta ricompensa non è banale. A causa delle restrizioni igieniche, l'uso di erbe fresche come ricompensa alimentare non è consentito in alcune strutture per animali da laboratorio e, pertanto, devono essere utilizzate ricompense alimentari meno appropriate come semi di girasole o prelibatezze di foraggiamento a base di cereali. Per quanto riguarda la decisione sulla ricompensa alimentare, alcune norme e regolamenti delle attuali pratiche di laboratorio sono dannose per il benessere degli animali e l'addestramento efficace e, pertanto, potrebbe essere necessario riconsiderare caso per caso. Potrebbe anche essere possibile utilizzare alternative alle ricompense alimentari, ad esempio tocchi delicati o interazioni con l'allenatore o articoli di arricchimento. Tuttavia, l'addestratore deve assicurarsi per ogni singolo animale che l'alternativa sia premiare l'animale perché una ricompensa è una ricompensa solo se il coniglio la favorisce davvero. Soprattutto i tocchi potrebbero non essere ricevuti come gratificanti da tutti i conigli.

Conclusioni

In sintesi, il presente studio è stato un primo passo per colmare il divario di conoscenze sui protocolli di addestramento adeguati per i conigli da laboratorio. Le femmine di coniglio bianco della Nuova Zelanda potrebbero essere addestrate per le procedure di allevamento di routine utilizzando il PRT e generalizzare i comportamenti obiettivo appresi ad altre persone, anche se dovrebbe essere riservato tempo aggiuntivo al processo di generalizzazione. I comportamenti obiettivo senza contatto fisico sembravano essere più facili da imparare rispetto ai comportamenti che richiedevano il contatto fisico con gli esseri umani. Dopo che gli animali hanno completato con successo l'addestramento di un comportamento obiettivo, era sufficiente recuperarli una volta alla settimana nel contesto dell'esame generale e della pulizia del recinto. I protocolli di addestramento considerati generalmente applicati a tutti i conigli sono convenienti, ma l'addestratore deve essere consapevole che, in alcuni casi, deve essere adattato alle esigenze dell'animale. I risultati sulle tecniche di manipolazione hanno suggerito che raccogliere i conigli con la scatola di trasporto invece di trattenerli per la collottola e sollevarli sul braccio era meno avverso. Nel complesso, gli attuali protocolli forniscono istruzioni fattibili per il processo di assuefazione e addestramento dei conigli e possono servire come perfezionamento nelle strutture per animali da laboratorio.

Gli animali non devono soffrire a causa del risparmio di lavoro, tempo o denaro (almeno secondo la legge tedesca sul benessere degli animali⁷²). È importante prendersi cura e gestire tutti gli animali nel modo più delicato possibile. Poiché gli animali non addestrati soffrono in misura maggiore di ansia e angoscia causati da procedure di allevamento sperimentali e di routine rispetto alle loro controparti addestrate¹³, l'addestramento è una semplice misura di perfezionamento per impedire loro di sperimentare stati affettivi negativi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bed-r' Nest	The Andersons, Inc., Maumee, USA		Il successo dell'implementazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Finger Clicker	ASCO		https://ascoshop.de/products/fingerclicker
G*Power		versione 3.1.9.7
Heu-Proppen	Ssniff Spezialdiä ten GmbH, Soest, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
IBM Corp. Rilasciato nel 2020. Statistiche IBM SPSS per Windows,  Armonk, NY: IBM Corp	IBM Corp	versione 27.0.	nel manoscritto indicato come "software per l'analisi statistica avanzata"
Kaninchen Haltung + 25 mg/kg di salinomicina-natrio-Sondermischung	Ssniff Spezialdiä ten GmbH, Soest, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Blocco Lignocel	Lignocel J. Rettenmaier & Sö hne GmbH + Co KG, Rosenberg, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Lillebro geschä lte Sonnenblumenkerne", Martina GmbH, Mü nchen, Germania) e Rainbow Foraging Bits (Bio-Serv, Flemington, USA)	Martina GmbH, Mü nchen, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Microsoft Excel per Microsoft 365 MSO	Microsoft Corporation	versione 2305	nel manoscritto indicato come "foglio di calcolo"
Conigli bianchi della Nuova Zelanda	Charles River Laboratories France
Plattformwaage DE 35K5DL	KERN & SOHN GmbH, Balingen-Frommern, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Lettiera scientifica premium (fine & flake)	SAFE, Augy, France		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Punte per foraggiamento arcobaleno	Bio-Serv, Flemington, USA		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Snackball fü r Kaninchen – 7 cm	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Bastone di bersaglio con clicker integrato	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germania		Il successo dell'implementazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Trixi Transportbox Capri Open Top	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.
Weiden-Heuball	JR FARM GmbH, Holzheim-Pessenburgheim, Germania		Il successo dell'attuazione del protocollo non dipende da questo particolare prodotto. Potresti utilizzare prodotti comparabili di altre aziende.