Helmonteringsbilleder til visualisering og kvantificering af perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisation
Summary
De nuværende protokoller beskriver ny helmonteret billeddannelse til visualisering af perifere strukturer i den okulære linse med metoder til billedkvantificering. Disse protokoller kan bruges i undersøgelser til bedre at forstå forholdet mellem linsemikroskalastrukturer og linseudvikling/funktion.
Abstract
Den okulære linse er et gennemsigtigt fleksibelt væv, der ændrer sin form for at fokusere lys fra forskellige afstande på nethinden. Bortset fra en kældermembran, der omgiver organet, kaldet kapslen, er linsen helt cellulær bestående af et monolag af epitelceller på den forreste halvkugle og en bulkmasse af linsefiberceller. Gennem hele livet spredes epitelceller i den spirende zone ved linseækvator, og ækvatoriale epitelceller migrerer, forlænger og differentierer sig til nydannede fiberceller. Ækvatoriale epitelceller ændrer væsentligt morfologi fra tilfældigt pakkede brostensformede celler til justerede sekskantformede celler, der danner meridionalrækker. Nydannede linsefiberceller bevarer den sekskantede celleform og forlænges mod de forreste og bageste poler og danner en ny skal af celler, der er overlejret på tidligere generationer af fibre. Lidt er kendt om de mekanismer, der driver den bemærkelsesværdige morfogenese af linseepitelceller til fiberceller. For bedre at forstå linsens struktur, udvikling og funktion er der udviklet nye billeddannelsesprotokoller til afbildning af perifere strukturer ved hjælp af hele monteringer af okulære linser. Her vises metoder til kvantificering af kapseltykkelse, epitelcelleareal, cellekerneområde og form, meridional rækkecellerækkefølge og pakning og fibercellebredder. Disse målinger er afgørende for at belyse de cellulære ændringer, der opstår under livslang linsevækst og forstå de ændringer, der opstår med alder eller patologi.
Introduction
Den okulære linse er et fleksibelt, gennemsigtigt væv placeret i den forreste del af øjet, der fungerer til finfokus lys på nethinden. Linsens evne til at fungere kan delvis tilskrives dens indviklede arkitektur og organisation 1,2,3,4,5,6. Omkring linsevævet er kapslen, en kældermembran, der er afgørende for at opretholde linsestruktur og biomekaniske egenskaber 7,8,9. Linsen selv er helt cellulær, bestående af to celletyper: epitel- og fiberceller. Epitellaget består af et monolag af kuboide celler, der dækker linsens forreste halvkugle10. Gennem hele livet spredes epitelcellerne og migrerer langs linsekapslen mod linseækvator. Forreste epitelceller er hvilende og brostensbelagte i tværsnit, og nær linseækvator formerer epitelceller sig og begynder at gennemgå differentieringsprocessen i nye fiberceller11,12. Ækvatoriale epitelceller omdannes fra tilfældigt pakkede celler til organiserede meridionalrækker med sekskantformede celler. Sekskantet celleform opretholdes på basalsiden af disse differentierende celler, mens den apikale side indsnævres og forankres ved linsens omdrejningspunkt eller modiolus 4,13,14,15. Da ækvatoriale epitelceller begynder at forlænge sig til nydannede fiberceller, migrerer cellernes apikale spidser langs den apikale overflade af forreste epitelceller mod den forreste pol, mens de basale spidser bevæger sig langs linsekapslen mod den bageste pol. Nye generationer af fiberceller overlejrer tidligere generationer af celler og skaber sfæriske skaller af fibre. Under celleforlængelses- og modningsprocessen ændrer fiberceller væsentligt deres morfologi 11,12,16. Disse fiberceller udgør hovedparten af linsemassen 11,12,16,17,18.
De molekylære mekanismer, der bidrager til etablering af indviklede linsemikrostrukturer, cellemorfologi og unik cellulær organisation, er ikke helt kendt. Desuden er linsekapslens og cellestrukturens bidrag til den samlede linsefunktion (gennemsigtighed, ændring af linseform) uklar. Imidlertid belyses disse forhold ved hjælp af nye billeddannelsesmetoder og kvantitative vurderinger af linsestrukturelle og cellulære egenskaber 2,4,19,20,21,22. Nye protokoller til billede af hele linser, der giver mulighed for visualisering med høj rumlig opløsning af linsekapslen, epitelceller og perifere fiberceller, er blevet udviklet. Dette inkluderer metode til kvantificering af kapseltykkelse, cellestørrelse, cellekernestørrelse og cirkularitet, meridional rækkerækkefølge, fibercellepakning og fibercellebredder. Disse visualiserings- og billedkvantificeringsmetoder muliggør dybdegående morfometrisk undersøgelse og har fordele i forhold til andre visualiseringsmetoder (billeddannelse af flade monteringer eller vævssektioner) ved at bevare den samlede 3D-vævsstruktur. Disse metoder har gjort det muligt at teste nye hypoteser og vil muliggøre fortsatte fremskridt i forståelsen af linsecellemønsterudvikling og funktion.
Til de følgende eksperimenter bruger vi vildtype- og Rosa26-tdTomat mus tandem dimer-Tomat (B6.129 (Cg) -GT (ROSA) (tdTomato) 23 (Jackson Laboratories) i C57BL / 6J baggrund mellem 6 og 10 uger af begge køn. tdTomato-musene giver mulighed for visualisering af cellulære plasmamembraner i levende linser via ekspression af tdTomat-protein fusioneret med de N-terminale 8 aminosyrer i et muteret MARCKS-protein, der er målrettet plasmamembranen via N-terminal myristylering og interne cystein-palmitoyleringssteder23. Vi bruger også NMIIAE1841K / E1841K mus24 oprindeligt opnået fra Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Som beskrevet tidligere20 er NMIIAE1841K / E1841K mus i FvBN / 129SvEv / C57Bl6 baggrund, der har tab af CP49 perleformet mellemliggende filamentprotein (opretholder moden fibercellemorfologi og hele linsebiomekanik), backcrossed med C57BL6 / J vildtypemus. Vi screenede afkomene for tilstedeværelsen af vildtypen CP49-allel.
Konfokal billeddannelse blev udført på et laserscanning konfokal fluorescensmikroskop med en 20x (NA = 0,8, arbejdsafstand = 0,55 mm, 1x zoom), en 40x (NA = 1,3 oliemål, arbejdsafstand = 0,2 mm, 1x zoom) eller en 63x (NA = 1,4 oliemål, arbejdsafstand = 0,19 mm, 1x zoom) forstørrelse. Alle billeder blev erhvervet ved hjælp af en pinhole størrelse, som er en determinant for optisk sektionstykkelse, til 1 Airy Unit (de resulterende optiske tykkelser er angivet i figurforklaringer). Billeder blev behandlet på Zen Software. Billeder blev eksporteret til .tif format og derefter importeret til FIJI ImageJ Software (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrevne protokoller muliggør visualisering med høj rumlig opløsning af perifere linsestrukturer og celler i linsens forreste og ækvatoriale regioner. I denne undersøgelse blev der vist metoder til visualisering af objektivets perifere strukturer ved hjælp af intakte (levende eller faste) linser, hvor den overordnede 3D-linsearkitektur bevares. Derudover blev der leveret enkle metoder til morfometrisk kvantitativ analyse ved hjælp af offentligt tilgængelig FIJI ImageJ-software. Hele monteringsvisualiserings- …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Eye Institute Grant R01 EY032056 til CC og R01 EY017724 til VMF samt National Institute of General Medical Sciences under bevillingsnummer P20GM139760. STI blev støttet af NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del af Chemistry-Biology Interface predoctoral træningsprogram og af en University of Delaware Graduate Scholars Award.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
