Beeldvorming van de hele montage om de perifere lensstructuur, celmorfologie en organisatie te visualiseren en te kwantificeren
Summary
De huidige protocollen beschrijven nieuwe beeldvorming van de hele montering voor de visualisatie van perifere structuren in de oculaire lens met methoden voor beeldkwantificering. Deze protocollen kunnen in onderzoeken worden gebruikt om de relatie tussen lensstructuren op microschaal en de ontwikkeling/functie van lenzen beter te begrijpen.
Abstract
De oculaire lens is een transparant flexibel weefsel dat van vorm verandert om licht van verschillende afstanden op het netvlies te focussen. Afgezien van een basaalmembraan rond het orgaan, de capsule genaamd, is de lens volledig cellulair en bestaat de lens uit een monolaag van epitheelcellen op de voorste hemisfeer en een bulkmassa lensvezelcellen. Gedurende het hele leven vermenigvuldigen epitheelcellen zich in de kiemzone bij de lensevenaar, en equatoriale epitheelcellen migreren, verlengen en differentiëren tot nieuw gevormde vezelcellen. Equatoriale epitheelcellen veranderen de morfologie aanzienlijk van willekeurig opeengepakte geplaveide cellen in uitgelijnde zeshoekige cellen die meridionale rijen vormen. Nieuw gevormde lensvezelcellen behouden de zeshoekige celvorm en strekken zich uit naar de voorste en achterste polen, waardoor een nieuwe schil van cellen wordt gevormd die over eerdere generaties vezels wordt gelegd. Er is weinig bekend over de mechanismen die de opmerkelijke morfogenese van lensepitheelcellen naar vezelcellen aansturen. Om de structuur, ontwikkeling en functie van lenzen beter te begrijpen, zijn nieuwe beeldvormingsprotocollen ontwikkeld om perifere structuren in beeld te brengen met behulp van hele vattingen van oculaire lenzen. Hier worden methoden getoond om de dikte van de capsule, het epitheelceloppervlak, het celkerngebied en de vorm, de volgorde en verpakking van meridionale rijcellen en de breedte van de vezelcellen te kwantificeren. Deze metingen zijn essentieel voor het ophelderen van de cellulaire veranderingen die optreden tijdens levenslange lensgroei en het begrijpen van de veranderingen die optreden met leeftijd of pathologie.
Introduction
De ooglens is een flexibel, transparant weefsel aan de voorkant van het oog dat functioneert om licht op het netvlies te focussen. Het vermogen van de lens om te functioneren kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de ingewikkelde architectuur en organisatie 1,2,3,4,5,6. Rondom het lensweefsel bevindt zich het kapsel, een basaalmembraan dat essentieel is voor het behoud van de lensstructuur en biomechanische eigenschappen 7,8,9. De lens zelf is volledig cellulair en bestaat uit twee celtypen: epitheel- en vezelcellen. De epitheellaag bestaat uit een monolaag van kubusvormige cellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekken10. Gedurende het hele leven vermenigvuldigen de epitheelcellen zich en migreren ze langs het lenskapsel naar de lensevenaar. Voorste epitheelcellen zijn rustig en geplaveid in doorsnede, en in de buurt van de evenaar van de lens vermenigvuldigen epitheelcellen zich en beginnen ze het differentiatieproces te ondergaan tot nieuwe vezelcellen11,12. Equatoriale epitheelcellen transformeren van willekeurig opeengepakte cellen in georganiseerde meridionale rijen met zeshoekige cellen. De zeshoekige celvorm wordt gehandhaafd aan de basale zijde van deze differentiërende cellen, terwijl de apicale zijde zich vernauwt en verankert aan het lensdraaipunt of modiolus 4,13,14,15. Naarmate de equatoriale epitheelcellen zich beginnen uit te strekken tot nieuw gevormde vezelcellen, migreren de apicale uiteinden van de cellen langs het apicale oppervlak van de voorste epitheelcellen naar de voorste pool, terwijl de basale uiteinden langs het lenskapsel naar de achterste pool bewegen. Nieuwe generaties vezelcellen overlappen eerdere generaties cellen, waardoor bolvormige schillen van vezels ontstaan. Tijdens het celverlengings- en rijpingsproces veranderen vezelcellen hun morfologie aanzienlijk 11,12,16. Deze vezelcellen vormen het grootste deel van de lensmassa 11,12,16,17,18.
De moleculaire mechanismen die bijdragen aan het tot stand brengen van ingewikkelde lensmicrostructuren, celmorfologie en unieke cellulaire organisatie zijn niet helemaal bekend. Bovendien is de bijdrage van het lenskapsel en de celstructuur aan de algehele lensfunctie (transparantie, lensvormverandering) onduidelijk. Deze relaties worden echter opgehelderd met behulp van nieuwe beeldvormingsmethodologie en kwantitatieve beoordelingen van structurele en cellulaire kenmerken van lenzen 2,4,19,20,21,22. Er zijn nieuwe protocollen ontwikkeld om hele lenzen in beeld te brengen die visualisatie met hoge ruimtelijke resolutie van het lenskapsel, de epitheelcellen en de perifere vezelcellen mogelijk maken. Dit omvat methodologie voor het kwantificeren van capsuledikte, celgrootte, celkerngrootte en circulariteit, meridionale rijvolgorde, vezelcelpakking en vezelcelbreedtes. Deze visualisatie- en beeldkwantificeringsmethoden maken diepgaand morfometrisch onderzoek mogelijk en hebben voordelen ten opzichte van andere visualisatiemethoden (beeldvorming van flatmounts of weefselsecties) door de algehele 3D-weefselstructuur te behouden. Deze methoden hebben het mogelijk gemaakt om nieuwe hypothesen te testen en zullen een voortdurende vooruitgang mogelijk maken in het begrip van de ontwikkeling en functie van lenscellen.
Voor de volgende experimenten gebruiken we wildtype en Rosa26-tdTomato muizen tandem dimeer-tomaat (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) in de C57BL/6J achtergrond tussen de leeftijd van 6 en 10 weken, van beide geslachten. De tdTomato-muizen maken visualisatie mogelijk van cellulaire plasmamembranen in levende lenzen via expressie van tdTomato-eiwit dat is gefuseerd met de N-terminale 8 aminozuren van een gemuteerd MARCKS-eiwit dat zich richt op het plasmamembraan via N-terminale myristylatie en interne cysteïne-palmitoylatieplaatsen23. We gebruiken ook NMIIAE1841K/E1841K muizen24 die oorspronkelijk zijn verkregen van Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Zoals eerder beschreven20, NMIIAE1841K/E1841K-muizen in FvBN/129SvEv/C57Bl6-achtergrond die verlies hebben van CP49 gepareld intermediair filamenteiwit (handhaaft volwassen vezelcelmorfologie en biomechanica van de hele lens), worden teruggekruist met C57BL6/J wildtype muizen. We hebben de nakomelingen gescreend op de aanwezigheid van het wildtype CP49-allel.
Confocale beeldvorming werd uitgevoerd op een confocale fluorescentiemicroscoop met laserscanning met een vergroting van 20x (NA = 0,8, werkafstand = 0,55 mm, 1x zoom), een vergroting van 40x (NA = 1,3 olieobjectief, werkafstand = 0,2 mm, 1x zoom) of een vergroting van 63x (NA = 1,4 olieobjectief, werkafstand = 0,19 mm, 1x zoom). Alle afbeeldingen zijn verkregen met behulp van een gaatjesgrootte, die een bepalende factor is voor de dikte van de optische doorsnede, tot 1 Airy Unit (de resulterende optische diktes worden vermeld in figuurlegenda’s). De beelden werden verwerkt met Zen-software. Afbeeldingen werden geëxporteerd naar .tif formaat en vervolgens geïmporteerd in FIJI ImageJ Software (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven protocollen maken visualisatie met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk van perifere lensstructuren en cellen in de voorste en equatoriale regio’s van de lens. In deze studie werden methoden getoond voor de visualisatie van perifere lensstructuren met behulp van intacte (onder spanning staande of vaste) lenzen waarbij de algehele 3D-lensarchitectuur behouden blijft. Daarnaast werden eenvoudige methoden voor morfometrische kwantitatieve analyse met behulp van openbaar beschikbare FIJI ImageJ-software aangebod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Eye Institute Grant R01 EY032056 aan CC en R01 EY017724 aan VMF, evenals het National Institute of General Medical Sciences onder subsidienummer P20GM139760. STI werd ondersteund door NIH-NIGMS T32-GM133395 als onderdeel van het predoctorale opleidingsprogramma Chemistry-Biology Interface, en door een University of Delaware Graduate Scholars Award.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
