הדמיה של תושבת שלמה כדי להמחיש ולכמת את מבנה העדשה ההיקפית, המורפולוגיה של התא והארגון
Summary
הפרוטוקולים הנוכחיים מתארים הדמיה חדשה של הר שלם להדמיית מבנים היקפיים בעדשת העין עם שיטות לכימות תמונה. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש במחקרים כדי להבין טוב יותר את הקשר בין מבנים מיקרוסקולריים של עדשה לבין התפתחות/תפקוד עדשה.
Abstract
עדשת העין היא רקמה גמישה שקופה המשנה את צורתה כדי למקד אור ממרחקים שונים על הרשתית. מלבד קרום מרתף המקיף את האיבר, הנקרא קפסולה, העדשה היא תאית לחלוטין המורכבת משכבה אחת של תאי אפיתל בחצי הכדור הקדמי וממסה גדולה של תאי סיבי עדשה. במהלך החיים, תאי אפיתל מתרבים באזור הנביטה בקו המשווה של העדשה, ותאי אפיתל משווניים נודדים, מתארכים, ומתמיינים לתאי סיבים שזה עתה נוצרו. תאי אפיתל משווניים משנים באופן משמעותי את המורפולוגיה מתאים בצורת אבן מרוצפת דחוסה באופן אקראי לתאים מיושרים בצורת משושה היוצרים שורות מרידיונליות. תאי סיבי עדשה חדשים שנוצרו שומרים על צורת התא המשושה ומתארכים לכיוון הקוטב הקדמי והאחורי, ויוצרים קליפה חדשה של תאים המונחים על דורות קודמים של סיבים. מעט ידוע על המנגנונים המניעים את המורפוגנזה יוצאת הדופן של תאי אפיתל עדשה לתאי סיבים. כדי להבין טוב יותר את מבנה העדשה, התפתחותה ותפקודה פותחו פרוטוקולי הדמיה חדשים כדי לדמות מבנים היקפיים באמצעות תושבות שלמות של עדשות עיניים. כאן מוצגות שיטות לכימות עובי הקפסולה, שטח תא אפיתל, אזור וצורה גרעיניים של התא, סדר ואריזה של תאי שורה מרידיאליים ורוחב תאי סיבים. מדידות אלה חיוניות להבהרת השינויים התאיים המתרחשים במהלך צמיחת העדשה לכל החיים ולהבנת השינויים המתרחשים עם הגיל או הפתולוגיה.
Introduction
עדשת העין היא רקמה גמישה ושקופה הממוקמת באזור הקדמי של העין ומתפקדת למיקוד עדין של האור על הרשתית. ניתן לייחס את יכולתה של העדשה לתפקד, בין השאר, לארכיטקטורה המורכבת שלהולארגון 1,2,3,4,5,6. סביב רקמת העדשה נמצאת הקפסולה, קרום מרתף חיוני לשמירה על מבנה העדשה ותכונות ביומכניות 7,8,9. העדשה עצמה היא תאית לחלוטין, ומורכבת משני סוגי תאים: תאי אפיתל ותאי סיבים. שכבת האפיתל מורכבת משכבה אחת של תאים קובואידים המכסים את ההמיספרה הקדמית של העדשה10. במהלך החיים, תאי האפיתל מתרבים ונודדים לאורך קפסולת העדשה לכיוון קו המשווה של העדשה. תאי אפיתל קדמיים הם שקטים ומרוצפים בחתך רוחב, וליד קו המשווה של העדשה, תאי אפיתל מתרבים ומתחילים לעבור את תהליך ההתמיינות לתאי סיבים חדשים11,12. תאי אפיתל משווניים הופכים מתאים ארוזים באופן אקראי לשורות מרידיונליות מאורגנות עם תאים בצורת משושה. צורת התא המשושה נשמרת בצד הבסיסי של תאים מתמיינים אלה בעוד הצד האפי מתכווץ ומעוגן בנקודת המשען של העדשה או modiolus 4,13,14,15. כאשר תאי האפיתל המשווני מתחילים להתארך לתאי סיבים שזה עתה נוצרו, הקצוות האפיקליים של התאים נודדים לאורך פני השטח האפיקליים של תאי אפיתל קדמיים לכיוון הקוטב הקדמי בעוד שקצות הבסיס נעים לאורך קפסולת העדשה לכיוון הקוטב האחורי. דורות חדשים של תאי סיבים מכסים את הדורות הקודמים של תאים, ויוצרים קליפות כדוריות של סיבים. במהלך תהליך התארכות והתבגרות התא, תאי סיבים משנים באופן משמעותי את המורפולוגיה שלהם 11,12,16. תאי סיבים אלה מהווים את עיקר מסת העדשה 11,12,16,17,18.
המנגנונים המולקולריים התורמים לביסוס מיקרו-מבנים מורכבים של עדשות, מורפולוגיה של תאים וארגון תאי ייחודי אינם ידועים לחלוטין. יתר על כן, תרומת קפסולת העדשה ומבנה התא לתפקוד הכולל של העדשה (שקיפות, שינוי צורת העדשה) אינה ברורה. עם זאת, יחסים אלה מובהרים באמצעות מתודולוגיית הדמיה חדשה והערכות כמותיות של תכונות מבניות ותאיות של עדשה 2,4,19,20,21,22. פותחו פרוטוקולים חדשים להדמיית עדשות שלמות המאפשרים הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה של קפסולת העדשה, תאי אפיתל ותאי סיבים היקפיים. זה כולל מתודולוגיה לכימות עובי הקפסולה, גודל התא, גודל גרעין התא ומעגליותו, סדר שורות מרידיונאלי, אריזת תאי סיבים ורוחב תאי סיבים. שיטות ויזואליזציה וכימות תמונה אלו מאפשרות בדיקה מורפומטרית מעמיקה ויש להן יתרונות על פני שיטות הדמיה אחרות (הדמיה של תושבות שטוחות או קטעי רקמות) על ידי שמירה על מבנה רקמה תלת ממדי כולל. שיטות אלה אפשרו לבחון השערות חדשות ויאפשרו המשך התקדמות בהבנת התפתחות תבנית תאי העדשה ותפקודם.
עבור הניסויים הבאים, אנו משתמשים בעכברי בר ועכברי Rosa26-tdTomato טנדם עגבנייה (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (מעבדות ג’קסון) ברקע C57BL/6J בין הגילאים 6 ל-10 שבועות, משני המינים. עכברי tdTomato מאפשרים הדמיה של קרומי פלזמה תאיים בעדשות חיות באמצעות ביטוי של חלבון tdTomato המאוחה לחומצות האמינו N-terminal 8 של חלבון MARCKS שעבר מוטציה ותוקף את קרום הפלזמה באמצעות N-terminal myristylation ואתרי ציסטאין-פלמיטוילציה פנימיים23. אנו משתמשים גם בעכברי NMIIAE1841K/E1841K 24 שהתקבלו במקור מד”ר רוברט אדלשטיין (המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, המכונים הלאומיים לבריאות, בת’סדה, MD). כפי שתואר קודם לכן20, עכברי NMIIAE1841K/E1841K ברקע FvBN/129SvEv/C57Bl6 שיש להם אובדן של חלבון נימה בינוני חרוזים CP49 (שומר על מורפולוגיית תאי סיבים בוגרים וביומכניקה של עדשה שלמה), מוצלבים לאחור עם עכברי בר מסוג C57BL6/J. סקרנו את הצאצאים לנוכחות של אלל CP49 מסוג פראי.
הדמיה קונפוקלית בוצעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי סורק לייזר עם הגדלה של 20x (NA = 0.8, מרחק עבודה = 0.55 מ”מ, זום 1x), 40x (NA = 1.3 מטרת שמן, מרחק עבודה = 0.2 מ”מ, זום 1x), או 63x (NA = 1.4 מטרת שמן, מרחק עבודה = 0.19 מ”מ, זום 1x). כל התמונות נרכשו באמצעות גודל חור סיכה, שהוא דטרמיננטה של עובי חתך אופטי, ליחידה אוורירית אחת (העובי האופטי המתקבל מצוין במקרא האיור). התמונות עובדו בתוכנת זן. התמונות יוצאו לפורמט .tif ולאחר מכן יובאו לתוכנת FIJI ImageJ (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה של מבני ותאים היקפיים של העדשה באזורים הקדמיים והמשווניים של העדשה. במחקר זה הוצגו שיטות להדמיה של מבנים היקפיים של עדשה באמצעות עדשות שלמות (חיות או קבועות) שבהן נשמרת ארכיטקטורת העדשה התלת-ממדית הכוללת. בנוסף, סופקו שיטות פשוטו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לעיניים מענק R01 EY032056 CC ו- R01 EY017724 ל- VMF, כמו גם המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים תחת מענק מספר P20GM139760. S.T.I נתמך על ידי NIH-NIGMS T32-GM133395 כחלק מתוכנית ההכשרה הקדם-דוקטורנטית של ממשק כימיה-ביולוגיה, ועל ידי פרס חוקרים לתארים מתקדמים של אוניברסיטת דלאוור.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
