Imaging a montaggio completo per visualizzare e quantificare la struttura periferica del cristallino, la morfologia e l'organizzazione cellulare
Summary
I presenti protocolli descrivono nuove immagini a montaggio intero per la visualizzazione di strutture periferiche nel cristallino oculare con metodi per la quantificazione dell’immagine. Questi protocolli possono essere utilizzati negli studi per comprendere meglio la relazione tra le strutture su microscala delle lenti e lo sviluppo/funzione delle lenti.
Abstract
Il cristallino oculare è un tessuto trasparente e flessibile che altera la sua forma per focalizzare la luce da diverse distanze sulla retina. A parte una membrana basale che circonda l’organo, chiamata capsula, il cristallino è interamente cellulare costituito da un monostrato di cellule epiteliali sull’emisfero anteriore e da una massa di cellule in fibra del cristallino. Nel corso della vita, le cellule epiteliali proliferano nella zona germinativa all’equatore del cristallino e le cellule epiteliali equatoriali migrano, si allungano e si differenziano in cellule fibrose di nuova formazione. Le cellule epiteliali equatoriali alterano sostanzialmente la morfologia da cellule a forma di ciottoli impacchettate in modo casuale in cellule a forma di esagono allineate che formano file meridionali. Le cellule delle fibre del cristallino appena formate mantengono la forma esagonale della cellula e si allungano verso i poli anteriore e posteriore, formando un nuovo guscio di cellule che si sovrappongono alle precedenti generazioni di fibre. Poco si sa sui meccanismi che guidano la notevole morfogenesi delle cellule epiteliali del cristallino in cellule fibrose. Per comprendere meglio la struttura, lo sviluppo e la funzione delle lenti, sono stati sviluppati nuovi protocolli di imaging per l’imaging delle strutture periferiche utilizzando interi supporti di lenti oculari. Qui vengono mostrati i metodi per quantificare lo spessore della capsula, l’area delle cellule epiteliali, l’area e la forma del nucleo cellulare, l’ordine e l’impacchettamento delle cellule della fila meridionale e le larghezze delle cellule delle fibre. Queste misurazioni sono essenziali per chiarire i cambiamenti cellulari che si verificano durante la crescita del cristallino per tutta la vita e comprendere i cambiamenti che si verificano con l’età o la patologia.
Introduction
Il cristallino oculare è un tessuto flessibile e trasparente situato nella regione anteriore dell’occhio che funziona per focalizzare finemente la luce sulla retina. La capacità di funzionamento dell’obiettivo può essere attribuita, in parte, alla sua intricata architettura e organizzazione 1,2,3,4,5,6. Intorno al tessuto del cristallino c’è la capsula, una membrana basale essenziale per mantenere la struttura del cristallino e le proprietà biomeccaniche 7,8,9. Il cristallino stesso è interamente cellulare, costituito da due tipi di cellule: cellule epiteliali e cellule fibrose. Lo strato epiteliale è costituito da un monostrato di cellule cuboidali che ricoprono l’emisfero anteriore del cristallino10. Nel corso della vita, le cellule epiteliali proliferano e migrano lungo la capsula del cristallino verso l’equatore del cristallino. Le cellule epiteliali anteriori sono quiescenti e a ciottoli in sezione trasversale e, vicino all’equatore del cristallino, le cellule epiteliali proliferano e iniziano a subire il processo di differenziazione in nuove cellule fibrose11,12. Le cellule epiteliali equatoriali si trasformano da cellule impacchettate in modo casuale in file meridionali organizzate con cellule a forma di esagono. La forma esagonale delle cellule viene mantenuta sul lato basale di queste cellule differenzianti, mentre il lato apicale si restringe e si ancora, al fulcro del cristallino o al modiolo 4,13,14,15. Quando le cellule epiteliali equatoriali iniziano ad allungarsi in cellule fibrose di nuova formazione, le punte apicali delle cellule migrano lungo la superficie apicale delle cellule epiteliali anteriori verso il polo anteriore mentre le punte basali si spostano lungo la capsula del cristallino verso il polo posteriore. Le nuove generazioni di celle in fibra si sovrappongono alle precedenti generazioni di celle, creando gusci sferici di fibre. Durante il processo di allungamento e maturazione cellulare, le cellule fibrose alterano sostanzialmente la loro morfologia 11,12,16. Queste cellule fibrose formano la maggior parte della massa del cristallino 11,12,16,17,18.
I meccanismi molecolari che contribuiscono a stabilire le intricate microstrutture del cristallino, la morfologia cellulare e l’organizzazione cellulare unica non sono del tutto noti. Inoltre, il contributo della capsula del cristallino e della struttura cellulare alla funzione complessiva del cristallino (trasparenza, cambiamento di forma del cristallino) non è chiaro. Tuttavia, queste relazioni sono state chiarite utilizzando una nuova metodologia di imaging e valutazioni quantitative delle caratteristiche strutturali e cellulari del cristallino 2,4,19,20,21,22. Sono stati sviluppati nuovi protocolli per l’imaging di lenti intere che consentono una visualizzazione ad alta risoluzione spaziale della capsula del cristallino, delle cellule epiteliali e delle cellule delle fibre periferiche. Ciò include la metodologia per quantificare lo spessore della capsula, la dimensione della cellula, la dimensione e la circolarità del nucleo cellulare, l’ordine delle file meridionali, l’impacchettamento delle cellule in fibra e le larghezze delle celle in fibra. Questi metodi di visualizzazione e quantificazione delle immagini consentono un esame morfometrico approfondito e presentano vantaggi rispetto ad altri metodi di visualizzazione (imaging di supporti piatti o sezioni di tessuto) preservando la struttura complessiva del tessuto 3D. Questi metodi hanno permesso di testare nuove ipotesi e consentiranno un continuo progresso nella comprensione dello sviluppo e della funzione del modello cellulare del cristallino.
Per i seguenti esperimenti, abbiamo utilizzato topi wild-type e Rosa26-tdTomato tandem dimero-Pomodoro (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) nel background C57BL/6J tra le 6 e le 10 settimane, di entrambi i sessi. I topi tdTomato consentono la visualizzazione delle membrane plasmatiche cellulari in lenti vive attraverso l’espressione della proteina tdTomato fusa con gli 8 amminoacidi N-terminali di una proteina MARCKS mutata che prende di mira la membrana plasmatica attraverso la miristilizzazione N-terminale e i siti interni di cisteina-palmitoilazione23. Utilizziamo anche topi NMIIAE1841K/E1841K 24 ottenuti originariamente dal Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Come descritto in precedenza20, topi NMIIAE1841K/E1841K in background FvBN/129SvEv/C57Bl6 che hanno perdita della proteina del filamento intermedio CP49 (mantiene la morfologia delle cellule a fibra matura e la biomeccanica dell’intera lente), sono reincrociati con topi wild-type C57BL6/J. Abbiamo esaminato la prole per la presenza dell’allele CP49 wild-type.
L’imaging confocale è stato eseguito su un microscopio a fluorescenza confocale a scansione laser con un ingrandimento 20x (NA = 0,8, distanza di lavoro = 0,55 mm, zoom 1x), 40x (NA = obiettivo a olio 1,3, distanza di lavoro = 0,2 mm, zoom 1x) o 63x (obiettivo a olio NA = 1,4, distanza di lavoro = 0,19 mm, zoom 1x). Tutte le immagini sono state acquisite utilizzando una dimensione del foro stenopeico, che è un determinante dello spessore della sezione ottica, a 1 unità di Airy (gli spessori ottici risultanti sono indicati nelle legende delle figure). Le immagini sono state elaborate con il software Zen. Le immagini sono state esportate in formato .tif e poi importate in FIJI ImageJ Software (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti consentono la visualizzazione ad alta risoluzione spaziale delle strutture e delle cellule periferiche del cristallino nelle regioni anteriori ed equatoriali del cristallino. In questo studio, sono stati mostrati metodi per la visualizzazione di strutture periferiche dell’obiettivo utilizzando lenti intatte (sotto tensione o fisse) in cui l’architettura complessiva dell’obiettivo 3D è preservata. Inoltre, sono stati forniti metodi semplici per l’analisi quantitativa morfometrica utilizzando il sof…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Eye Institute Grant R01 EY032056 to CC e R01 EY017724 al VMF, nonché dal National Institute of General Medical Sciences con il numero di sovvenzione P20GM139760. S.T.I è stato supportato da NIH-NIGMS T32-GM133395 come parte del programma di formazione pre-dottorato Chemistry-Biology Interface e da un premio per studiosi laureati dell’Università del Delaware.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
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