末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング
Summary
現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。
Abstract
眼球レンズは透明で柔軟な組織で、その形状を変化させてさまざまな距離からの光を網膜に集束させます。水晶体は、被膜と呼ばれる器官を取り囲む基底膜を除けば、前半球の上皮細胞の単層と水晶体線維細胞の塊からなる完全な細胞である。上皮細胞は生涯を通じて水晶体赤道の発芽帯で増殖し、赤道上皮細胞は遊走、伸長、分化して新たに形成された線維細胞になります。赤道上皮細胞は、ランダムに詰め込まれた丸石型の細胞から、子午線列を形成する整列した六角形の細胞に形態を実質的に変化させます。新たに形成されたレンズ線維細胞は、六角形の細胞形状を保持し、前極および後極に向かって伸び、前世代の線維に重ねられた細胞の新しいシェルを形成します。水晶体上皮細胞から線維細胞への顕著な形態形成を促進するメカニズムについてはほとんど知られていません。レンズの構造、発達、機能をよりよく理解するために、接眼レンズのマウント全体を使用して末梢構造を画像化する新しいイメージングプロトコルが開発されました。ここでは、カプセルの厚さ、上皮細胞面積、細胞核面積と形状、子午線列細胞の順序と充填、および繊維細胞幅を定量する方法を示します。これらの測定は、生涯にわたる水晶体の成長中に発生する細胞の変化を解明し、加齢や病態によって発生する変化を理解するために不可欠です。
Introduction
眼水晶体は、眼の前部に位置する柔軟で透明な組織で、網膜に光を細かく合わせる役割を果たします。レンズが機能する能力は、部分的には、その複雑なアーキテクチャと構成に起因する可能性があります1,2,3,4,5,6。水晶体組織を取り囲むのは、水晶体構造と生体力学的特性を維持するために不可欠な基底膜であるカプセルです7,8,9。水晶体自体は完全に細胞状で、上皮細胞と繊維細胞の2種類の細胞で構成されています。上皮層は、レンズ10の前半球を覆う直方体細胞の単層からなる。生涯を通じて、上皮細胞は増殖し、水晶体嚢に沿って水晶体赤道に向かって移動します。前上皮細胞は断面が静止し、丸石であり、水晶体赤道付近では上皮細胞が増殖し、新しい線維細胞への分化過程を経始める11,12。赤道上皮細胞は、ランダムに詰められた細胞から、六角形の細胞を持つ組織化された子午線列に変化します。これらの分化細胞の基底側では六角形の細胞形状が維持され、頂端側は水晶体の支点またはモディオラスで収縮して固定されます4,13,14,15。赤道上皮細胞が新たに形成された線維細胞に伸長し始めると、細胞の頂端先端は前上皮細胞の頂端表面に沿って前極に向かって移動し、基底の先端は水晶体嚢に沿って後極に向かって移動します。新世代の繊維細胞は、前世代の細胞に重なり、繊維の球状の殻を形成します。細胞の伸長および成熟過程において、繊維細胞はそれらの形態を実質的に変化させる11,12,16。これらの繊維セルは、レンズ質量11、12、16、17、18の大部分を形成する。
複雑な水晶体の微細構造、細胞形態、およびユニークな細胞組織の確立に寄与する分子メカニズムは、完全にはわかっていません。さらに、水晶体嚢と細胞構造が水晶体全体の機能(透明度、水晶体形状の変化)に寄与するかどうかは不明です。しかし、これらの関係は、新しいイメージング方法論と、水晶体の構造的および細胞的特徴の定量的評価を使用して解明されています2,4,19,20,21,22。水晶体嚢、上皮細胞、末梢線維細胞の高空間分解能可視化を可能にするレンズ全体を画像化するための新しいプロトコルが開発されました。これには、カプセルの厚さ、細胞サイズ、細胞核のサイズと真円度、子午線の行順序、繊維細胞の充填、および繊維細胞の幅を定量化する方法論が含まれます。これらの可視化および画像定量化法は、詳細な形態測定検査を可能にし、全体的な3D組織構造を保持することにより、他の可視化法(フラットマウントまたは組織切片のイメージング)よりも優れています。これらの方法により、新しい仮説の検証が可能になり、水晶体細胞パターンの発達と機能の理解が継続的に進むことが期待されます。
以下の実験では、野生型およびRosa26-tdTomatoマウスのタンデム二量体-トマト(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)(tdTomato)23 (Jackson Laboratories))を、雌雄6週齢から10週齢までのC57BL/6Jバックグラウンドで使用しました。tdTomatoマウスは、N末端ミリスチル化および内部システイン-パルミトイル化部位を介して原形質膜を標的とする変異MARCKSタンパク質のN末端8アミノ酸に融合したtdTomatoタンパク質の発現により、ライブレンズ内の細胞原形質膜の可視化を可能にする23。また、Robert Adelstein博士(National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD)から入手したNMIIAE1841K/E1841K マウス24 も用いる。前述したように、20に示すように、CP49ビーズ状中間フィラメントタンパク質の欠損(成熟した線維細胞の形態および全水晶体バイオメカニクスを維持する)を有するFvBN/129SvEv/C57Bl6バックグラウンドのNMIIAE1841K/E1841Kマウスを、C57BL6/J野生型マウスと戻し交配した。野生型CP49対立遺伝子の存在について子孫をスクリーニングしました。
共焦点イメージングは、20倍(NA=0.8、作動距離=0.55mm、1倍ズーム)、40倍(NA=1.3オイル対物レンズ、作動距離=0.2mm、1倍ズーム)、または63倍(NA=1.4オイル対物レンズ、作動距離=0.19mm、1倍ズーム)のレーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡で行った。すべての画像は、光学断面の厚さの決定要因であるピンホールサイズを使用して、1エアリーユニットで取得されました(結果の光学厚さは図の凡例に記載されています)。画像はZen Softwareで処理しました。画像は.tif形式にエクスポートされ、FIJI ImageJ Software (imageJ.net) にインポートされました。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されているプロトコルは、水晶体の前方および赤道領域における周辺レンズ構造および細胞の高空間分解能の視覚化を可能にします。本研究では、3次元レンズ全体の構造が保たれたインタクトレンズ(ライブレンズまたは固定レンズ)を用いて、レンズ周辺構造を可視化する手法を示した。さらに、一般に公開されているFIJI ImageJソフトウェアを使用した形態測定定量分析の簡単な方法も?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CCにEY032056された国立眼科研究所の助成金R01とVMFにEY017724されたR01、および助成金番号P20GM139760の国立総合医学研究所の支援を受けました。S.T.Iは、化学-生物学インターフェース博士課程前研修プログラムの一環として、NIH-NIGMS T32-GM133395、およびデラウェア大学大学院奨学生賞の支援を受けました。
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
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