Helmonteringsavbildning for å visualisere og kvantifisere perifer linsestruktur, cellemorfologi og organisasjon
Summary
De foreliggende protokollene beskriver ny helmonteringsavbildning for visualisering av perifere strukturer i okularlinsen med metoder for bildekvantifisering. Disse protokollene kan brukes i studier for å bedre forstå forholdet mellom linsemikroskalastrukturer og linsens utvikling/funksjon.
Abstract
Den okulære linsen er et gjennomsiktig, fleksibelt vev som endrer form for å fokusere lys fra forskjellige avstander på netthinnen. Bortsett fra en kjellermembran som omgir orgelet, kalt kapselen, er linsen helt cellulær bestående av et monolag av epitelceller på den fremre halvkule og en bulkmasse av linsefiberceller. Gjennom livet prolifererer epitelceller i den spirende sonen ved linseekvator, og ekvatoriale epitelceller migrerer, forlenger og differensierer til nydannede fiberceller. Ekvatoriale epitelceller endrer vesentlig morfologi fra tilfeldig pakkede brosteinformede celler til justerte sekskantformede celler som danner meridionale rader. Nydannede linsefiberceller beholder den sekskantede celleformen og strekker seg mot de fremre og bakre polene, og danner et nytt skall av celler som er lagt på tidligere generasjoner av fibre. Lite er kjent om mekanismene som driver den bemerkelsesverdige morfogenesen av linseepitelceller til fiberceller. For bedre å forstå linsestruktur, utvikling og funksjon, har nye bildebehandlingsprotokoller blitt utviklet for å avbilde perifere strukturer ved hjelp av hele monteringer av okulære linser. Her vises metoder for å kvantifisere kapseltykkelse, epitelcelleareal, cellekjerneområde og form, meridional radcelleorden og pakking, og fibercellebredder. Disse målingene er avgjørende for å belyse de cellulære endringene som skjer under livslang linsevekst og forstå endringene som skjer med alder eller patologi.
Introduction
Den okulære linsen er et fleksibelt, gjennomsiktig vev som ligger i den fremre delen av øyet som fungerer for å finfokusere lys på netthinnen. Linsens evne til å fungere kan delvis tilskrives dens intrikate arkitektur og organisasjon 1,2,3,4,5,6. Rundt linsevevet er kapselen, en kjellermembran som er avgjørende for å opprettholde linsestruktur og biomekaniske egenskaper 7,8,9. Linsen i seg selv er helt cellulær, bestående av to celletyper: epitel- og fiberceller. Epitellaget består av et monolag av kuboidale celler som dekker linsens fremre halvkule10. Gjennom livet sprer epitelcellene seg og migrerer langs linsekapselen mot linseekvator. Fremre epitelceller er hvilende og brostein i tverrsnitt, og nær linseekvator prolifererer epitelceller og begynner å gjennomgå differensieringsprosessen til nye fiberceller11,12. Ekvatoriale epitelceller forvandles fra tilfeldig pakkede celler til organiserte meridionale rader med sekskantformede celler. Sekskantet celleform opprettholdes på basalsiden av disse differensierende cellene mens den apikale siden trekker seg sammen og forankres ved linsens dreiepunkt eller modiolus 4,13,14,15. Når de ekvatoriale epitelcellene begynner å strekke seg til nydannede fiberceller, migrerer de apikale spissene av cellene langs den apikale overflaten av fremre epitelceller mot den fremre polen mens basalspissene beveger seg langs linsekapselen mot den bakre polen. Nye generasjoner av fiberceller legger over tidligere generasjoner av celler, og skaper sfæriske skall av fibre. Under celleforlengelses- og modningsprosessen endrer fiberceller vesentlig sin morfologi 11,12,16. Disse fibercellene danner hoveddelen av linsemassen 11,12,16,17,18.
De molekylære mekanismene som bidrar til å etablere intrikate linsemikrostrukturer, cellemorfologi og unik cellulær organisasjon er ikke helt kjent. Videre er linsekapselens og cellestrukturens bidrag til den generelle linsefunksjonen (gjennomsiktighet, linseformendring) uklart. Imidlertid blir disse forholdene belyst ved hjelp av ny bildebehandlingsmetodikk og kvantitative vurderinger av linsestrukturelle og cellulære egenskaper 2,4,19,20,21,22. Nye protokoller for å avbilde hele linser som muliggjør visualisering med høy romlig oppløsning av linsekapselen, epitelceller og perifere fiberceller har blitt utviklet. Dette inkluderer metodikk for å kvantifisere kapseltykkelse, cellestørrelse, cellekjernestørrelse og sirkularitet, meridional radrekkefølge, fibercellepakking og fibercellebredder. Disse visualiserings- og bildekvantifiseringsmetodene tillater grundig morfometrisk undersøkelse og har fordeler i forhold til andre visualiseringsmetoder (avbildning av flate fester eller vevsseksjoner) ved å bevare den generelle 3D-vevstrukturen. Disse metodene har gjort det mulig å teste nye hypoteser og vil muliggjøre fortsatt fremgang i forståelsen av linsecellemønsterutvikling og funksjon.
For følgende eksperimenter bruker vi villtype og Rosa26-tdTomatmus tandemdimer-tomat (B6.129 (Cg) -Gt (ROSA) (tdTomato) 23 (Jackson Laboratories) i C57BL/6J-bakgrunnen mellom 6 og 10 uker, av begge kjønn. tdTomato-musene tillater visualisering av cellulære plasmamembraner i levende linser via ekspresjon av tdTomatoprotein fusjonert til N-terminal 8-aminosyrene i et mutert MARCKS-protein som retter seg mot plasmamembranen via N-terminal myristylering og interne cysteinpalmitoyleringssteder23. Vi bruker også NMIIAE1841K / E1841K mus24 hentet opprinnelig fra Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Som beskrevet tidligere20, NMIIAE1841K / E1841K mus i FvBN / 129SvEv / C57Bl6 bakgrunn som har tap av CP49 beaded intermediært filament protein (opprettholder moden fibercellemorfologi og hel linse biomekanikk), er tilbakekrysset med C57BL6 / J villtype mus. Vi screenet avkommet for tilstedeværelse av villtype CP49-allelet.
Konfokal avbildning ble utført på et laserskanning konfokalfluorescensmikroskop med en 20x (NA = 0.8, arbeidsavstand = 0.55mm, 1x zoom), en 40x (NA = 1.3 oljemål, arbeidsavstand = 0.2mm, 1x zoom), eller en 63x (NA = 1.4 oljeobjektiv, arbeidsavstand = 0.19mm, 1x zoom) forstørrelse. Alle bildene ble tatt ved hjelp av en pinhole størrelse, som er en determinant av optisk seksjon tykkelse, til 1 Airy Unit (de resulterende optiske tykkelser er angitt i figur legender). Bilder ble behandlet på Zen Software. Bildene ble eksportert til .tif format og deretter importert til FIJI ImageJ Software (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrevne protokollene muliggjør visualisering av høy romlig oppløsning av perifere linsestrukturer og celler i linsens fremre og ekvatoriale regioner. I denne studien ble det vist metoder for visualisering av linsens perifere strukturer ved bruk av intakte (levende eller faste) linser der den generelle 3D-linsearkitekturen er bevart. I tillegg ble enkle metoder for morfometrisk kvantitativ analyse ved hjelp av offentlig tilgjengelig FIJI ImageJ-programvare gitt. Hele monteringsvisualiserings- og kvantifiseringsmet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Eye Institute Grant R01 EY032056 til CC og R01 EY017724 til VMF, samt National Institute of General Medical Sciences under tilskuddsnummer P20GM139760. STI ble støttet av NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del av Chemistry-Biology Interface predoctoral training program, og av en University of Delaware Graduate Scholars Award.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
