Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula
Summary
Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.
Abstract
A lente ocular é um tecido flexível transparente que altera sua forma para focalizar a luz de diferentes distâncias na retina. Além de uma membrana basal que envolve o órgão, chamada de cápsula, o cristalino é inteiramente celular consistindo de uma monocamada de células epiteliais no hemisfério anterior e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino. Ao longo da vida, as células epiteliais proliferam na zona germinativa no equador do cristalino, e as células epiteliais equatoriais migram, alongam-se e diferenciam-se em células de fibras recém-formadas. As células epiteliais equatoriais alteram substancialmente a morfologia de células em forma de paralelepípedo aleatoriamente embaladas em células alinhadas em forma de hexágono formando fileiras meridionais. As células de fibras do cristalino recém-formadas retêm a forma de célula hexagonal e se alongam em direção aos polos anterior e posterior, formando uma nova camada de células que são sobrepostas às gerações anteriores de fibras. Pouco se sabe sobre os mecanismos que conduzem a notável morfogênese das células epiteliais do cristalino para as células fibrosas. Para melhor entender a estrutura, o desenvolvimento e a função das lentes, novos protocolos de imagem foram desenvolvidos para obter imagens de estruturas periféricas usando montagens inteiras de lentes oculares. Aqui, métodos para quantificar a espessura da cápsula, a área celular epitelial, a área e a forma nuclear da célula, a ordem e o empacotamento das células da linha meridional e as larguras das células de fibra são mostrados. Essas medidas são essenciais para elucidar as mudanças celulares que ocorrem durante o crescimento do cristalino ao longo da vida e entender as mudanças que ocorrem com a idade ou patologia.
Introduction
A lente ocular é um tecido flexível e transparente situado na região anterior do olho que tem a função de focalizar a luz na retina. A capacidade de funcionamento da lente pode ser atribuída, em parte, à sua intrincada arquitetura e organização 1,2,3,4,5,6. Ao redor do tecido do cristalino encontra-se a cápsula, membrana basal essencial para a manutenção da estrutura e das propriedades biomecânicasdo cristalino 7,8,9. O cristalino em si é inteiramente celular, consistindo de dois tipos celulares: células epiteliais e fibras. A camada epitelial é constituída por uma monocamada de células cuboidais que recobre o hemisfério anterior docristalino10. Ao longo da vida, as células epiteliais proliferam e migram ao longo da cápsula do cristalino em direção ao equador do cristalino. As células epiteliais anteriores são quiescentes e em corte transversal e, próximo ao equador do cristalino, as células epiteliais proliferam e passam a sofrer o processo de diferenciação em novas célulasfibrosas11,12. As células epiteliais equatoriais transformam-se de células aleatoriamente embaladas em fileiras meridionais organizadas com células em forma de hexágono. A forma das células hexagonais é mantida na face basal dessas células diferenciadoras enquanto a face apical se contrai e ancora no fulcro do cristalino ou modíolo4,13,14,15. À medida que as células epiteliais equatoriais começam a se alongar em células de fibras recém-formadas, as pontas apicais das células migram ao longo da superfície apical das células epiteliais anteriores em direção ao polo anterior, enquanto as pontas basais se movem ao longo da cápsula do cristalino em direção ao polo posterior. Novas gerações de células de fibra sobrepõem gerações anteriores de células, criando cascas esféricas de fibras. Durante o processo de alongamento e maturação celular, as células fibrosas alteram substancialmente sua morfologia 11,12,16. Essas células fibrosas formam a maior parte da massa do cristalino 11,12,16,17,18.
Os mecanismos moleculares que contribuem para o estabelecimento de intrincadas microestruturas do cristalino, morfologia celular e organização celular única não são totalmente conhecidos. Além disso, a contribuição da cápsula da lente e da estrutura celular para a função geral da lente (transparência, mudança de forma da lente) não é clara. No entanto, essas relações estão sendo elucidadas por meio de nova metodologia de imagem e avaliações quantitativas das características estruturais e celulares do cristalino2,4,19,20,21,22. Novos protocolos para obtenção de imagens de lentes inteiras que permitem a visualização em alta resolução espacial da cápsula do cristalino, células epiteliais e células de fibras periféricas foram desenvolvidos. Isso inclui metodologia para quantificar a espessura da cápsula, o tamanho da célula, o tamanho e a circularidade do núcleo da célula, a ordem meridional da linha, o empacotamento da célula da fibra e a largura da célula da fibra. Esses métodos de visualização e quantificação de imagens permitem um exame morfométrico aprofundado e têm vantagens sobre outros métodos de visualização (imagens de montagens planas ou cortes de tecido) por preservarem a estrutura global do tecido 3D. Esses métodos têm permitido o teste de novas hipóteses e permitirão o avanço contínuo na compreensão do desenvolvimento e da função do padrão celular do cristalino.
Para os experimentos a seguir, utilizamos camundongos selvagens e Rosa26-tdTomato tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) no fundo C57BL/6J entre as idades de 6 e 10 semanas, de ambos os sexos. Os camundongos tdTomato permitem a visualização das membranas plasmáticas celulares em lentes vivas via expressão da proteína tdTomato fusionada aos 8 aminoácidos N-terminais de uma proteína MARCKS mutada que tem como alvo a membrana plasmática via miristilação N-terminal e sítios internos de cisteína-palmitoilação23. Também usamos camundongos NMIIAE1841K/E1841K 24 obtidos originalmente do Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Como descrito anteriormente20, camundongos NMIIAE1841K/E1841K em FvBN/129SvEv/C57Bl6 de fundo que tem perda da proteína de filamento intermediário frisada CP49 (mantém a morfologia de células de fibra madura e biomecânica de lente inteira), são retrocruzados com camundongos selvagens C57BL6/J. Nós selecionamos a prole para a presença do alelo selvagem CP49.
As imagens confocais foram realizadas em microscópio confocal de fluorescência a laser com aumento de 20x (NA = 0,8, distância de trabalho = 0,55mm, zoom de 1x), 40x (NA = 1,3 objetiva de óleo, distância de trabalho = 0,2mm, zoom de 1x) ou 63x (NA = 1,4 objetiva de óleo, distância de trabalho = 0,19mm, zoom de 1x). Todas as imagens foram adquiridas usando um tamanho de orifício, que é um determinante da espessura da seção óptica, para 1 Unidade Airy (as espessuras ópticas resultantes são indicadas nas legendas das figuras). As imagens foram processadas no software Zen. As imagens foram exportadas para .tif formato e importadas para o software FIJI ImageJ (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos descritos permitem a visualização em alta resolução espacial das estruturas e células periféricas do cristalino nas regiões anterior e equatorial do cristalino. Neste estudo, métodos para a visualização das estruturas periféricas das lentes usando lentes intactas (vivas ou fixas) onde a arquitetura geral da lente 3D é preservada foram mostrados. Adicionalmente, métodos simples para análise morfométrica quantitativa usando o software FIJI ImageJ disponível publicamente foram fornecidos. Os m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo National Eye Institute Grant R01 EY032056 para CC e R01 EY017724 para VMF, bem como pelo National Institute of General Medical Sciences sob o número de P20GM139760. S.T.I foi apoiado pelo NIH-NIGMS T32-GM133395 como parte do programa de treinamento pré-doutoral da Interface Química-Biologia e por um Prêmio de Pós-Graduação da Universidade de Delaware.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
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