Визуализация всего крепления для визуализации и количественной оценки структуры периферического хрусталика, морфологии и организации клеток
Summary
В представленных протоколах описаны новые методы визуализации с помощью всей монтировки для визуализации периферических структур в окулярном хрусталике с методами количественной оценки изображения. Эти протоколы могут быть использованы в исследованиях, чтобы лучше понять взаимосвязь между микромасштабными структурами хрусталика и развитием/функцией хрусталика.
Abstract
Окулярная линза представляет собой прозрачную гибкую ткань, которая изменяет свою форму, чтобы фокусировать свет с разных расстояний на сетчатке. За исключением базальной мембраны, окружающей орган, называемой капсулой, хрусталик полностью клеточный, состоящий из монослоя эпителиальных клеток в переднем полушарии и объемной массы клеток волокон хрусталика. На протяжении всей жизни эпителиальные клетки пролиферируют в зародышевой зоне на экваторе хрусталика, а экваториальные эпителиальные клетки мигрируют, удлиняются и дифференцируются во вновь образованные волоконные клетки. Экваториальные эпителиальные клетки существенно изменяют морфологию от хаотично упакованных булыжных клеток к выровненным шестиугольным клеткам, образующим меридиональные ряды. Вновь сформированные клетки волокон хрусталика сохраняют гексагональную клеточную форму и удлиняются к переднему и заднему полюсам, образуя новую оболочку клеток, которые накладываются на предыдущие поколения волокон. Мало что известно о механизмах, которые управляют замечательным морфогенезом эпителиальных клеток хрусталика в волоконные клетки. Для лучшего понимания структуры, развития и функционирования хрусталика были разработаны новые протоколы визуализации периферических структур с использованием целых креплений окулярных линз. Здесь показаны методы количественной оценки толщины капсулы, площади эпителиальных клеток, площади и формы ядра клетки, меридионального порядка и упаковки клеток, а также ширины клеток волокна. Эти измерения необходимы для выяснения клеточных изменений, которые происходят во время роста хрусталика на протяжении всей жизни, и понимания изменений, которые происходят с возрастом или патологией.
Introduction
Окулярная линза представляет собой гибкую, прозрачную ткань, расположенную в передней части глаза, которая функционирует для точной фокусировки света на сетчатке. Способность объектива функционировать можно объяснить, в частности, его сложной архитектурой и организацией 1,2,3,4,5,6. Ткань хрусталика окружает капсула, базальная мембрана, необходимая для поддержания структуры хрусталика и биомеханических свойств 7,8,9. Сам хрусталик полностью клеточный, состоящий из двух типов клеток: эпителиальных и волоконных. Эпителиальный слой состоит из монослоя кубовидных клеток, покрывающих переднюю полусферу хрусталика10. На протяжении всей жизни эпителиальные клетки размножаются и мигрируют вдоль капсулы хрусталика к экватору хрусталика. Клетки переднего эпителия находятся в состоянии покоя и имеют булыжный разрез в поперечном сечении, а вблизи хрусталика эпителиальные клетки пролиферируют и начинают процесс дифференцировки в новые волоконные клетки11,12. Клетки экваториального эпителия превращаются из хаотично упакованных клеток в организованные меридиональные ряды с клетками шестиугольной формы. Гексагональная форма клеток сохраняется на базальной стороне этих дифференцирующих клеток, в то время как апикальная сторона сужается и закрепляется на точке опоры хрусталика или модиоле 4,13,14,15. По мере того, как экваториальные эпителиальные клетки начинают удлиняться во вновь образованные волоконные клетки, апикальные кончики клеток мигрируют вдоль апикальной поверхности передних эпителиальных клеток к переднему полюсу, в то время как базальные кончики перемещаются вдоль капсулы хрусталика к заднему полюсу. Новые поколения волоконных клеток накладываются на предыдущие, создавая сферические оболочки волокон. В процессе удлинения и созревания клеток волокна существенно изменяют свою морфологию 11,12,16. Эти волокнистые клетки составляют основную массу хрусталика 11,12,16,17,18.
Молекулярные механизмы, способствующие установлению сложных микроструктур хрусталика, морфологии клеток и уникальной клеточной организации, до конца не изучены. Кроме того, вклад капсулы хрусталика и клеточной структуры в общую функцию хрусталика (прозрачность, изменение формы хрусталика) неясен. Тем не менее, эти взаимосвязи выясняются с помощью новой методологии визуализации и количественной оценки структурных и клеточных особенностей хрусталика 2,4,19,20,21,22. Были разработаны новые протоколы визуализации целых хрусталиков, которые позволяют визуализировать капсулу хрусталика, эпителиальные клетки и клетки периферических волокон с высоким пространственным разрешением. Это включает в себя методологию количественного определения толщины капсулы, размера клеток, размера и округлости ядра клетки, меридионального порядка ряда, упаковки клеток волокна и ширины ячеек волокна. Эти методы визуализации и количественной оценки изображений позволяют проводить углубленное морфометрическое исследование и имеют преимущества перед другими методами визуализации (визуализация плоских креплений или срезов тканей) за счет сохранения общей 3D-структуры ткани. Эти методы позволили проверить новые гипотезы и позволят продолжить прогресс в понимании развития и функционирования клеток хрусталика.
Для следующих экспериментов мы использовали мышей дикого типа и мышей Rosa26-tdTomato в тандеме димер-томат (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) на фоне C57BL/6J в возрасте от 6 до 10 недель обоего пола. Мыши tdTomato позволяют визуализировать клеточные плазматические мембраны в живых хрусталиках через экспрессию белка tdTomato, слитого с N-концевыми аминокислотами 8 мутировавшего белка MARKS, который нацелен на плазматическую мембрану через N-концевую миристилизацию и внутренние сайты цистеин-пальмитоилирования23. Мы также используем мышейNMIIA E1841K/E1841K 24 , полученных от доктора Роберта Адельштейна (Национальный институт сердца, легких и крови, Национальный институт здоровья, Бетесда, штат Мэриленд). Как описаноранее, мышей NMIIAE1841K/E1841K на фоне FvBN/129SvEv/C57Bl6, у которых отсутствует белок промежуточной нити CP49 (поддерживает морфологию зрелых волоконных клеток и биомеханику всего хрусталика), скрещивают с мышами дикого типа C57BL6/J. Мы провели скрининг потомства на наличие аллеля CP49 дикого типа.
Конфокальную визуализацию проводили на лазерном сканирующем конфокальном флуоресцентном микроскопе с увеличением 20x (NA = 0,8, рабочее расстояние = 0,55 мм, 1x увеличение), 40x (NA = 1,3 масляный объектив, рабочее расстояние = 0,2 мм, 1x увеличение) или 63x (NA = 1,4 масляный объектив, рабочее расстояние = 0,19 мм, 1x увеличение). Все изображения были получены с использованием размера точечного отверстия, который является определяющим толщину оптического сечения, с точностью до 1 единицы Эйри (результирующие оптические толщины указаны в подписях на рисунках). Изображения были обработаны на Zen Software. Изображения были экспортированы в формат .tif, а затем импортированы в программное обеспечение FIJI ImageJ (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные протоколы позволяют визуализировать периферические структуры и клетки хрусталика в передней и экваториальной областях хрусталика с высоким пространственным разрешением. В данном исследовании были показаны методы визуализации периферических структур линз с использовани?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом R01 Национального института глаз EY032056 для CC и R01 EY017724 для VMF, а также Национальным институтом общих медицинских наук в рамках гранта No P20GM139760. S.T.I был поддержан NIH-NIGMS T32-GM133395 в рамках программы подготовки докторантов Chemistry-Biology Interface, а также премией University of Delaware Graduate Scholars Award.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
