Imágenes de montura completa para visualizar y cuantificar la estructura, la morfología y la organización de las lentes periféricas
Summary
Los protocolos actuales describen nuevas imágenes de montaje completo para la visualización de estructuras periféricas en el cristalino ocular con métodos para la cuantificación de imágenes. Estos protocolos se pueden utilizar en estudios para comprender mejor la relación entre las estructuras a microescala del cristalino y el desarrollo/función del cristalino.
Abstract
El cristalino ocular es un tejido transparente y flexible que altera su forma para enfocar la luz desde diferentes distancias en la retina. Aparte de una membrana basal que rodea el órgano, llamada cápsula, el cristalino es completamente celular y consiste en una monocapa de células epiteliales en el hemisferio anterior y una masa masiva de células de fibra del cristalino. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan en la zona germinativa en el ecuador del cristalino, y las células epiteliales ecuatoriales migran, se alargan y se diferencian en células de fibra recién formadas. Las células epiteliales ecuatoriales alteran sustancialmente la morfología de células empaquetadas al azar en forma de adoquín a células alineadas en forma de hexágono que forman filas meridionales. Las células de fibra del cristalino recién formadas conservan la forma de célula hexagonal y se alargan hacia los polos anterior y posterior, formando una nueva capa de células que se superponen a las generaciones anteriores de fibras. Poco se sabe sobre los mecanismos que conducen a la notable morfogénesis de las células epiteliales del cristalino a las células fibra. Para comprender mejor la estructura, el desarrollo y la función de las lentes, se han desarrollado nuevos protocolos de obtención de imágenes para obtener imágenes de estructuras periféricas utilizando monturas completas de lentes oculares. Aquí, se muestran métodos para cuantificar el grosor de la cápsula, el área de las células epiteliales, el área y la forma del núcleo de la célula, el orden y el empaquetamiento de las células de la fila meridional y el ancho de las células de las fibras. Estas mediciones son esenciales para dilucidar los cambios celulares que ocurren durante el crecimiento del cristalino a lo largo de la vida y comprender los cambios que ocurren con la edad o la patología.
Introduction
El cristalino ocular es un tejido flexible y transparente situado en la región anterior del ojo que funciona para enfocar la luz en la retina. La capacidad de funcionamiento de la lente se puede atribuir, en parte, a su intrincada arquitectura y organización 1,2,3,4,5,6. Alrededor del tejido del cristalino se encuentra la cápsula, una membrana basal esencial para mantener la estructura del cristalino y las propiedades biomecánicas 7,8,9. El cristalino en sí es completamente celular, y consta de dos tipos de células: epiteliales y fibrosas. La capa epitelial está formada por una monocapa de células cuboidales que recubren el hemisferio anterior del cristalino10. A lo largo de la vida, las células epiteliales proliferan y migran a lo largo de la cápsula del cristalino hacia el ecuador del cristalino. Las células epiteliales anteriores están en reposo y en sección transversal, y cerca del ecuador del cristalino, las células epiteliales proliferan y comienzan a experimentar el proceso de diferenciación en nuevas células de fibra11,12. Las células epiteliales ecuatoriales se transforman de células empaquetadas al azar en filas meridionales organizadas con células en forma de hexágono. La forma de las células hexagonales se mantiene en el lado basal de estas células diferenciadoras, mientras que el lado apical se contrae y se ancla en el punto de apoyo del cristalino o modiolo 4,13,14,15. A medida que las células epiteliales ecuatoriales comienzan a alargarse en células fibrosas recién formadas, las puntas apicales de las células migran a lo largo de la superficie apical de las células epiteliales anteriores hacia el polo anterior, mientras que las puntas basales se mueven a lo largo de la cápsula del cristalino hacia el polo posterior. Las nuevas generaciones de células de fibra se superponen a las generaciones anteriores de células, creando capas esféricas de fibras. Durante el proceso de elongación y maduración celular, las células de fibra alteran sustancialmente su morfología 11,12,16. Estas células de fibra forman la mayor parte de la masa del cristalino 11,12,16,17,18.
Los mecanismos moleculares que contribuyen al establecimiento de las intrincadas microestructuras del cristalino, la morfología celular y la organización celular única no se conocen del todo. Además, la contribución de la cápsula del cristalino y la estructura celular a la función general del cristalino (transparencia, cambio de forma del cristal) no está clara. Sin embargo, estas relaciones están siendo dilucidadas utilizando una nueva metodología de imagen y evaluaciones cuantitativas de las características estructurales y celulares del cristalino 2,4,19,20,21,22. Se han desarrollado nuevos protocolos para obtener imágenes de lentes completas que permiten la visualización de alta resolución espacial de la cápsula del cristalino, las células epiteliales y las células de fibra periférica. Esto incluye la metodología para cuantificar el grosor de la cápsula, el tamaño de la célula, el tamaño y la circularidad del núcleo celular, el orden de las hileras meridionales, el empaquetamiento de las células de fibra y el ancho de las células de fibra. Estos métodos de visualización y cuantificación de imágenes permiten un examen morfométrico en profundidad y tienen ventajas sobre otros métodos de visualización (imágenes de montajes planos o secciones de tejido) al preservar la estructura general del tejido en 3D. Estos métodos han permitido probar nuevas hipótesis y permitirán un avance continuo en la comprensión del desarrollo y la función del patrón de las células del cristalino.
Para los siguientes experimentos, utilizamos ratones de tipo salvaje y Rosa26-tdTomato tándem dímero-Tomate (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) en el fondo C57BL/6J entre las edades de 6 y 10 semanas, de ambos sexos. Los ratones tdTomato permiten la visualización de las membranas plasmáticas celulares en lentes vivas a través de la expresión de la proteína tdTomato fusionada con los aminoácidos N-terminal 8 de una proteína MARCKS mutada que se dirige a la membrana plasmática a través de la miritilación N-terminal y los sitios internos de cisteína-palmitoilación23. También utilizamos ratones NMIIAE1841K/E1841K 24 obtenidos originalmente del Dr. Robert Adelstein (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). Como se describió anteriormente20, los ratones NMIIAE1841K/E1841K en el fondo FvBN/129SvEv/C57Bl6 que tienen pérdida de la proteína de filamento intermedio con perlas CP49 (mantiene la morfología de la célula de fibra madura y la biomecánica del cristalino completo), se retrocruzan con ratones de tipo salvaje C57BL6/J. Examinamos a las crías para detectar la presencia del alelo CP49 de tipo salvaje.
Las imágenes confocales se realizaron en un microscopio de fluorescencia confocal de barrido láser con un aumento de 20x (NA = 0,8, distancia de trabajo = 0,55 mm, zoom 1x), 40x (NA = 1,3 objetivo de aceite, distancia de trabajo = 0,2 mm, zoom de 1x) o 63x (NA = objetivo de aceite de 1,4, distancia de trabajo = 0,19 mm, zoom de 1x). Todas las imágenes se adquirieron utilizando un tamaño estenopeico, que es un determinante del espesor de la sección óptica, a 1 unidad de Airy (los espesores ópticos resultantes se indican en las leyendas de las figuras). Las imágenes fueron procesadas en Zen Software. Las imágenes se exportaron a .tif formato y luego se importaron al software FIJI ImageJ (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos permiten la visualización de alta resolución espacial de las estructuras y células periféricas del cristalino en las regiones anterior y ecuatorial del cristalino. En este estudio, se mostraron métodos para la visualización de estructuras periféricas de lentes utilizando lentes intactas (vivas o fijas) donde se conserva la arquitectura general de la lente 3D. Además, se proporcionaron métodos simples para el análisis cuantitativo morfométrico utilizando el software FIJI ImageJ disponib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención R01 del Instituto Nacional del Ojo EY032056 a CC y R01 EY017724 a VMF, así como por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo la subvención número P20GM139760. S.T.I recibió el apoyo de NIH-NIGMS T32-GM133395 como parte del programa de capacitación predoctoral Chemistry-Biology Interface, y de un premio Graduate Scholars Award de la Universidad de Delaware.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
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