Helmonterad avbildning för att visualisera och kvantifiera perifer linsstruktur, cellmorfologi och organisation
Summary
De aktuella protokollen beskriver nya helfattningsavbildningar för visualisering av perifera strukturer i den okulära linsen med metoder för bildkvantifiering. Dessa protokoll kan användas i studier för att bättre förstå förhållandet mellan linsstrukturer i mikroskala och linsutveckling/funktion.
Abstract
Ögonlinsen är en genomskinlig flexibel vävnad som ändrar sin form för att fokusera ljus från olika avstånd på näthinnan. Bortsett från ett basalmembran som omger organet, kallat kapseln, är linsen helt cellulär och består av ett monolager av epitelceller på den främre halvklotet och en bulkmassa av linsfiberceller. Under hela livet förökar sig epitelceller i den groende zonen vid linsens ekvator, och ekvatoriella epitelceller migrerar, förlängs och differentieras till nybildade fiberceller. Ekvatoriella epitelceller förändrar väsentligt morfologin från slumpmässigt packade kullerstensformade celler till inriktade hexagonformade celler som bildar meridionala rader. Nybildade linsfiberceller behåller den sexkantiga cellformen och förlängs mot de främre och bakre polerna och bildar ett nytt skal av celler som läggs ovanpå tidigare generationer av fibrer. Lite är känt om de mekanismer som driver den anmärkningsvärda morfogenesen av linsepitelceller till fiberceller. För att bättre förstå linsens struktur, utveckling och funktion har nya avbildningsprotokoll utvecklats för att avbilda perifera strukturer med hjälp av hela fästen av okulära linser. Här visas metoder för att kvantifiera kapseltjocklek, epitelcellarea, cellkärnarea och form, meridional radcellordning och packning samt fibercellbredder. Dessa mätningar är viktiga för att belysa de cellulära förändringar som uppstår under livslång linstillväxt och förstå de förändringar som uppstår med ålder eller patologi.
Introduction
Den okulära linsen är en flexibel, genomskinlig vävnad som ligger i ögats främre region och som fungerar för att finfokusera ljuset på näthinnan. Linsens förmåga att fungera kan delvis tillskrivas dess intrikata arkitektur och organisation 1,2,3,4,5,6. Runt linsvävnaden finns kapseln, ett basalmembran som är nödvändigt för att upprätthålla linsens struktur och biomekaniska egenskaper 7,8,9. Själva linsen är helt cellulär och består av två celltyper: epitelceller och fiberceller. Epitelskiktet består av ett monolager av kuboidala celler som täcker den främre halvklotet av linsen10. Under hela livet förökar sig epitelcellerna och migrerar längs linskapseln mot linsekvatorn. Främre epitelceller är vilande och kullerstensbelagda i tvärsnitt, och nära linsekvatorn förökar sig epitelceller och börjar genomgå differentieringsprocessen till nya fiberceller11,12. Ekvatoriella epitelceller omvandlas från slumpmässigt packade celler till organiserade meridionala rader med hexagonformade celler. Den sexkantiga cellformen bibehålls på basalsidan av dessa differentierande celler medan den apikala sidan drar ihop sig och förankras vid linsens stödpunkt eller modiolus 4,13,14,15. När de ekvatoriella epitelcellerna börjar förlängas till nybildade fiberceller, migrerar cellernas apikala spetsar längs den apikala ytan av främre epitelceller mot den främre polen medan de basala spetsarna rör sig längs linskapseln mot den bakre polen. Nya generationer av fiberceller överlagrar tidigare generationer av celler och skapar sfäriska skal av fibrer. Under cellförlängnings- och mognadsprocessen förändrar fibercellerna väsentligt sin morfologi 11,12,16. Dessa fiberceller utgör huvuddelen av linsmassan 11,12,16,17,18.
De molekylära mekanismerna som bidrar till att etablera intrikata linsmikrostrukturer, cellmorfologi och unik cellulär organisation är inte helt kända. Dessutom är linskapselns och cellstrukturens bidrag till linsens övergripande funktion (transparens, förändring av linsformen) oklart. Dessa samband klarläggs dock med hjälp av ny avbildningsmetodik och kvantitativa bedömningar av linsens strukturella och cellulära egenskaper 2,4,19,20,21,22. Nya protokoll för att avbilda hela linser som möjliggör visualisering av linskapseln, epitelceller och perifera fiberceller med hög rumslig upplösning har utvecklats. Detta inkluderar metodik för att kvantifiera kapseltjocklek, cellstorlek, cellkärnstorlek och cirkularitet, meridional radordning, fibercellpackning och fibercellbredder. Dessa visualiserings- och bildkvantifieringsmetoder möjliggör djupgående morfometrisk undersökning och har fördelar jämfört med andra visualiseringsmetoder (avbildning av platta fästen eller vävnadssnitt) genom att bevara den övergripande 3D-vävnadsstrukturen. Dessa metoder har gjort det möjligt att testa nya hypoteser och kommer att möjliggöra fortsatta framsteg i förståelsen av linscellers utveckling och funktion.
För följande experiment använder vi vildtyps- och Rosa26-tdTomato-möss tandemdimer-Tomat (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) i C57BL/6J-bakgrunden mellan 6 och 10 veckor, av båda könen. tdTomato-mössen möjliggör visualisering av cellulära plasmamembran i levande linser via uttryck av tdTomato-protein smält till N-terminal 8-aminosyrorna i ett muterat MARCKS-protein som riktar sig mot plasmamembranet via N-terminal myristylation och interna cystein-palmitoyleringsställen23. Vi använder också NMIIAE1841K/E1841K-möss 24 som ursprungligen erhållits från Dr. Robert Adelstein (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Som beskrivits tidigare20 är NMIIAE1841K/E1841K-möss i FvBN/129SvEv/C57Bl6-bakgrund som har förlust av CP49-pärlstav intermediärt filamentprotein (bibehåller mogen fibercellmorfologi och hela linsens biomekanik), återkorsade med C57BL6/J-vildtypsmöss. Vi screenade avkomman för förekomst av den vilda CP49-allelen.
Konfokal avbildning utfördes på ett konfokalfluorescensmikroskop med laserskanning med 20x (NA = 0,8, arbetsavstånd = 0,55 mm, 1x zoom), 40x (NA = 1,3 oljeobjektiv, arbetsavstånd = 0,2 mm, 1x zoom) eller 63x (NA = 1,4 oljeobjektiv, arbetsavstånd = 0,19 mm, 1x zoom) förstoring. Alla bilder togs med hjälp av en nålhålsstorlek, som är en determinant för optisk sektionstjocklek, till 1 Airy Unit (de resulterande optiska tjocklekarna anges i figurförklaringar). Bilderna bearbetades på Zen Software. Bilderna exporterades till .tif format och importerades sedan till FIJI ImageJ Software (imageJ.net).
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrivna protokollen möjliggör visualisering med hög rumslig upplösning av perifera linsstrukturer och celler vid linsens främre och ekvatoriella regioner. I denna studie visades metoder för visualisering av perifera strukturer med hjälp av intakta (levande eller fasta) linser där den övergripande 3D-linsarkitekturen bevaras. Dessutom tillhandahölls enkla metoder för morfometrisk kvantitativ analys med hjälp av offentligt tillgänglig FIJI ImageJ-programvara. Hela monteringsvisualiserings- och kvantifieri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Eye Institute Grant R01 EY032056 till CC och R01 EY017724 till VMF, samt National Institute of General Medical Sciences under anslagsnummer P20GM139760. STI stöddes av NIH-NIGMS T32-GM133395 som en del av Chemistry-Biology Interface predoktorala utbildningsprogram och av ett University of Delaware Graduate Scholars Award.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
