Periferik lens yapısını, hücre morfolojisini ve organizasyonunu görselleştirmek ve ölçmek için tam montajlı görüntüleme
Summary
Mevcut protokoller, oküler lensteki periferik yapıların görüntü niceleme yöntemleriyle görselleştirilmesi için yeni tam montajlı görüntülemeyi tanımlamaktadır. Bu protokoller, lens mikro ölçekli yapıları ile lens gelişimi/işlevi arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için yapılan çalışmalarda kullanılabilir.
Abstract
Oküler lens, ışığı farklı mesafelerden retinaya odaklamak için şeklini değiştiren şeffaf esnek bir dokudur. Kapsül adı verilen organı çevreleyen bir bazal zarın yanı sıra, lens, ön hemisferde tek katmanlı bir epitel hücresi tabakası ve bir yığın lens lifi hücresi kütlesinden oluşan tamamen hücreseldir. Yaşam boyunca, epitel hücreleri lens ekvatorundaki çimlenme bölgesinde çoğalır ve ekvatoral epitel hücreleri göç eder, uzar ve yeni oluşan lif hücrelerine farklılaşır. Ekvatoral epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş parke taşı şeklindeki hücrelerden morfolojiyi, meridyen sıraları oluşturan hizalanmış altıgen şekilli hücrelere büyük ölçüde değiştirir. Yeni oluşan mercek lifi hücreleri, altıgen hücre şeklini korur ve ön ve arka kutuplara doğru uzar, böylece önceki nesil liflerin üzerine binen yeni bir hücre kabuğu oluşturur. Lens epitel hücrelerinin lif hücrelerine dikkat çekici morfogenezini yönlendiren mekanizmalar hakkında çok az şey bilinmektedir. Lens yapısını, gelişimini ve işlevini daha iyi anlamak için, tüm oküler lens yuvalarını kullanarak periferik yapıları görüntülemek için yeni görüntüleme protokolleri geliştirilmiştir. Burada, kapsül kalınlığını, epitel hücre alanını, hücre nükleer alanını ve şeklini, meridyen sıra hücre sırasını ve paketlemesini ve lif hücre genişliklerini ölçme yöntemleri gösterilmektedir. Bu ölçümler, yaşam boyu lens büyümesi sırasında meydana gelen hücresel değişiklikleri aydınlatmak ve yaş veya patoloji ile meydana gelen değişiklikleri anlamak için gereklidir.
Introduction
Oküler lens, gözün ön bölgesinde yer alan ve ışığı retinaya ince odaklama işlevi gören esnek, şeffaf bir dokudur. Lensin işlev görme yeteneği, kısmen karmaşık mimarisine ve organizasyonunabağlanabilir 1,2,3,4,5,6. Lens dokusunu çevreleyen, lens yapısını ve biyomekanik özelliklerini korumak için gerekli olan bir bazal membranolan kapsüldür 7,8,9. Lensin kendisi tamamen hücreseldir ve iki hücre tipinden oluşur: epitelyal ve fiber hücreler. Epitel tabakası, lensin10 ön hemisferini kaplayan tek bir küboidal hücre tabakasından oluşur. Yaşam boyunca, epitel hücreleri çoğalır ve lens kapsülü boyunca lens ekvatoruna doğru göç eder. Anterior epitel hücreleri enine kesitte hareketsiz ve parke taşıdır ve lens ekvatorunun yakınında epitel hücreleri çoğalır ve yeni lif hücrelerine farklılaşma sürecinden geçmeye başlar11,12. Ekvator epitel hücreleri, rastgele paketlenmiş hücrelerden altıgen şekilli hücrelerle organize meridyen sıralarına dönüşür. Altıgen hücre şekli, bu farklılaşan hücrelerin bazal tarafında korunurken, apikal taraf lens dayanak noktasında veya modiolus 4,13,14,15’te daralır ve sabitlenir. Ekvatoral epitel hücreleri yeni oluşan lif hücrelerine uzamaya başladığında, hücrelerin apikal uçları ön epitel hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca ön kutba doğru hareket ederken, bazal uçlar lens kapsülü boyunca arka kutba doğru hareket eder. Yeni nesil fiber hücreler, önceki nesil hücrelerin üzerini kaplayarak küresel lif kabukları oluşturur. Hücre uzaması ve olgunlaşma süreci sırasında, lif hücreleri morfolojilerini önemli ölçüde değiştirir 11,12,16. Bu lif hücreleri, lens kütlesinin 11,12,16,17,18 kütlesini oluşturur.
Karmaşık lens mikro yapılarının, hücre morfolojisinin ve benzersiz hücresel organizasyonun kurulmasına katkıda bulunan moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Ayrıca, lens kapsülünün ve hücre yapısının genel lens fonksiyonuna (saydamlık, lens şekli değişikliği) katkısı belirsizdir. Bununla birlikte, bu ilişkiler yeni görüntüleme metodolojisi ve lens yapısal ve hücresel özelliklerinin kantitatif değerlendirmeleri kullanılarak aydınlatılmaktadır2,4,19,20,21,22. Lens kapsülünün, epitel hücrelerinin ve periferik fiber hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlükte görüntülenmesine izin veren tüm lensleri görüntülemek için yeni protokoller geliştirilmiştir. Bu, kapsül kalınlığını, hücre boyutunu, hücre çekirdeği boyutunu ve daireselliğini, meridyen sıra sırasını, fiber hücre paketlemesini ve fiber hücre genişliklerini ölçmek için metodolojiyi içerir. Bu görselleştirme ve görüntü niceleme yöntemleri, derinlemesine morfometrik incelemeye izin verir ve genel 3D doku yapısını koruyarak diğer görselleştirme yöntemlerine (düz bağlantıların veya doku kesitlerinin görüntülenmesi) göre avantajlara sahiptir. Bu yöntemler, yeni hipotezlerin test edilmesine izin vermiştir ve lens hücresi paterni gelişimi ve işlevinin anlaşılmasında sürekli ilerlemeyi sağlayacaktır.
Aşağıdaki deneyler için, her iki cinsiyetten 6 ila 10 haftalık yaşlar arasında C57BL/6J arka planında vahşi tip ve Rosa26-tdDomates fareleri tandem dimer-Domates (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) kullanıyoruz. tdTomato fareleri, N-terminal miristilasyon ve iç sistein-palmitoilasyon bölgeleri23 yoluyla plazma zarını hedef alan mutasyona uğramış bir MARCKS proteininin N-terminal 8 amino asitlerine kaynaşmış tdTomato proteininin ekspresyonu yoluyla canlı lenslerde hücresel plazma zarlarının görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca orijinal olarak Dr. Robert Adelstein’dan (Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) elde edilen NMIIAE1841K / E1841K fareleri24 kullanıyoruz. Daha önce açıklandığı gibi, CP49 boncuklu ara filament proteini kaybına sahip (olgun lif hücresi morfolojisini ve tüm lens biyomekaniğini korur) FvBN/129SvEv/C57Bl6 arka planındaki NMIIAE1841K/E1841K fareleri, C57BL6/J vahşi tip farelerle geri çaprazlanır. Yavruları vahşi tip CP49 alelinin varlığı açısından taradık.
Konfokal görüntüleme, 20x (NA = 0.8, çalışma mesafesi = 0.55mm, 1x yakınlaştırma), 40x (NA = 1.3 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.2mm, 1x yakınlaştırma) veya 63x (NA = 1.4 yağ objektifi, çalışma mesafesi = 0.19mm, 1x yakınlaştırma) büyütme ile lazer taramalı konfokal floresan mikroskobu üzerinde gerçekleştirildi. Tüm görüntüler, optik kesit kalınlığının belirleyicisi olan iğne deliği boyutu kullanılarak 1 Airy Unit’e kadar elde edilmiştir (ortaya çıkan optik kalınlıklar şekil açıklamalarında belirtilmiştir). Görüntüler Zen Software’de işlendi. Görüntüler .tif formatta dışa aktarıldı ve ardından FIJI ImageJ Yazılımına (imageJ.net) aktarıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokoller, lensin ön ve ekvator bölgelerindeki periferik lens yapılarının ve hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlar. Bu çalışmada, genel 3D lens mimarisinin korunduğu sağlam (canlı veya sabit) lensler kullanılarak lens çevre yapılarının görüntülenmesine yönelik yöntemler gösterilmiştir. Ek olarak, halka açık FIJI ImageJ yazılımı kullanılarak morfometrik kantitatif analiz için basit yöntemler sağlanmıştır. Tüm montaj görselleştirm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, CC’ye EY032056 Ulusal Göz Enstitüsü Hibe R01 ve VMF’ye EY017724 R01’in yanı sıra P20GM139760 numaralı hibe numarası altında Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. S.T.I, Kimya-Biyoloji Arayüzü doktora öncesi eğitim programının bir parçası olarak NIH-NIGMS T32-GM133395 ve Delaware Üniversitesi Lisansüstü Akademisyenler Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
References
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
- Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
- Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
- Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
- Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129 (2022).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
- Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086 (2023).
- Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101 (1929).
- Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
- Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
- Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695 (2017).
- Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
- Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
- Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. . Development of the Ocular Lens. , (2011).
- Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
- Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
- Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638 (2023).
- Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20 (2023).
- Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376 (2021).
- Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178 (2022).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986 (2016).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).
