Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

Summary

Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.

Abstract

Der kontinuierlich wachsende Maus-Schneidezahn entwickelt sich zu einem sehr handhabbaren Modellsystem, um die Regulation adulter epithelialer und mesenchymaler Stammzellen und die Zahnregeneration zu untersuchen. Diese Vorläuferpopulationen teilen, bewegen und differenzieren sich aktiv, um die Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten und verlorene Zellen regenerieren. Herkömmliche Analysen mit fixierten Gewebeschnitten konnten jedoch die dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen nicht erfassen, was unsere Fähigkeit, ihre Regulationsmechanismen zu untersuchen, einschränkte. In dieser Arbeit wird ein Protokoll beschrieben, um ganze Mausschneidezähne in einem Explantatkultursystem zu erhalten und dentale Epithelzellen mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffermikroskopie live zu verfolgen. Diese Technik ergänzt unseren bestehenden Werkzeugkasten für die zahnmedizinische Forschung und ermöglicht es Forschern, raumzeitliche Informationen über das Verhalten und die Organisation von Zellen in einem lebenden Gewebe zu gewinnen. Wir gehen davon aus, dass diese Methodik den Forschern helfen wird, die Mechanismen weiter zu erforschen, die die dynamischen zellulären Prozesse steuern, die sowohl während der Zahnerneuerung als auch der Zahnregeneration stattfinden.

Introduction

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Schneidezahn der Maus zu einer unschätzbaren Plattform für die Erforschung der Prinzipien der Regulation adulter Stammzellen und der Zahnregeneration entwickelt ^1,2. Der Schneidezahn der Maus wächst kontinuierlich und erneuert sich während des gesamten Lebens des Tieres. Dies geschieht durch die Erhaltung sowohl epithelialer als auch mesenchymaler Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelltypen des Zahns differenzieren können ^1,2. Während aus dentalen Epithelstammzellen Ameloblasten entst....

Protocol

Alle Mäuse wurden in pathogenfreien Tiereinrichtungen an der University of California Los Angeles (UCLA) oder der Hebrew University of Jerusalem (HUJI) gehalten. Alle Experimente mit Mäusen wurden gemäß den Vorschriften und Protokollen durchgeführt, die vom jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden (ARC-2019-013; UCLA) oder (MD-23-17184-3; HUJI). Ein allgemeiner Ablauf der Versuchsschritte ist in Abbildung 2A dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Instrumenten, Reagenzien und Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

Results

Die apikale Region des adulten Mausschneidezahns ist vom Unterkiefer umhüllt (Abbildung 1) und daher nicht direkt zugänglich, um die Vorläuferzellen, die sich in der Wachstumsregion befinden, zu visualisieren und live zu verfolgen. Daher haben wir eine Methode entwickelt, um den gesamten Schneidezahn aus dem Kieferknochen zu extrahieren und in einem Explantatkultursystem für die Zwei-Photonen-Zeitraffermikroskopie zu erhalten (Abbildung 2). Hier beschreiben wir .......

Discussion

Die Bildgebung von Live-Gewebe ist eine wichtige Technik, die es uns ermöglicht, die dynamischen Prozesse und Verhaltensweisen von Zellen zu untersuchen, wenn sie in ihrer Nischenumgebung gehalten werden⁴¹. Im Idealfall wird die Live-Bildgebung in vivo mit hoher raumzeitlicher Auflösung durchgeführt. Die In-vivo-Bildgebung von Säugetierorganen kann jedoch aufgrund der Unzugänglichkeit des Gewebes, der optischen Undurchsichtigkeit und der Schwierigkeit, das Tier oder das Organ übe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well, flacher Boden Gewebekulturplatte	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR Wassertauchobjektiv	Leica	11507704
Ascorbinsäure (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glukose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T System	Bioptechs	0420-4	Inklusive Temperaturregelung, Kulturschalen und Perfusionseinrichtung
Dissektionsmikroskop - LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basalmedien ohne Phenolrot
Chirurgische Klinge Feder (#15)	Feder	72044-15
Feine Pinzette	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutaminersatz
Leica SP8-DIVE ausgestattet mit einem 25X HC IRAPO motCORR Wassertauchobjektiv	Leica	n/a
niedrigschmelzende Agarose	NuSieve	50080
nicht-essentielle Aminosäuren (100x)	Thermo Scientific	11140-050
Penicillin– Streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10.000 U/ml
Petrischale	Gen Klon	32-107G	90 mm
Rattenserum	Valley Biomedical	AS3061SC	Verarbeitet für Live-Imaging
Rasierklinge #9	VWR	55411-050
Skalpellgriff	F.S.T	10003-12
Schere	F.S.T	37133
gezackte Pinzette	F.S.T	11000-13
Federschere	F.S.T	91500-09