Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

Summary

L’imaging dal vivo ex vivo è una potente tecnica per studiare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari nei tessuti viventi. Qui, presentiamo un protocollo che implementa la microscopia a due fotoni per tracciare in tempo reale le cellule epiteliali dentali in incisivi di topo adulti interi in coltura.

Abstract

L’incisivo di topo in continua crescita sta emergendo come un sistema modello altamente trattabile per studiare la regolazione delle cellule staminali epiteliali e mesenchimali adulte e la rigenerazione dei denti. Queste popolazioni progenitrici si dividono, si muovono e si differenziano attivamente per mantenere l’omeostasi tissutale e rigenerare le cellule perse in modo reattivo. Tuttavia, le analisi tradizionali che utilizzano sezioni fisse di tessuto non sono in grado di catturare i processi dinamici dei movimenti e delle interazioni cellulari, limitando la nostra capacità di studiarne le regolazioni. Questo articolo descrive un protocollo per mantenere gli incisivi interi di topo in un sistema di coltura di espianto e cellule epiteliali dentali live-track utilizzando la microscopia timelapse multifotone. Questa tecnica si aggiunge alla nostra cassetta degli attrezzi esistente per la ricerca odontoiatrica e consente ai ricercatori di acquisire informazioni spazio-temporali sui comportamenti e le organizzazioni delle cellule in un tessuto vivente. Prevediamo che questa metodologia aiuterà i ricercatori a esplorare ulteriormente i meccanismi che controllano i processi cellulari dinamici che avvengono sia durante il rinnovamento che la rigenerazione dentale.

Introduction

Negli ultimi due decenni, l’incisivo di topo è emerso come una piattaforma inestimabile per studiare i principi della regolazione delle cellule staminali adulte e della rigenerazione dei denti ^1,2. L’incisivo del topo cresce continuamente e si rinnova per tutta la vita dell’animale. Lo fa mantenendo sia le cellule staminali epiteliali che quelle mesenchimali, che possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in diversi tipi di cellule del dente ^1,2. Mentre le cellule staminali epiteliali dentali danno origine ad ameloblasti, che secernono la matrice dello smalto, le cellule staminali mesenchimali dentali danno origine a odontoblasti, cementoblasti e fibroblasti, che formano dentina, cemento e legamento parodontale, rispettivamente 3,4,5,6. Questo apporto costante di nuove cellule mantiene l’omeostasi dei tessuti e consente la sostituzione delle vecchie cellule perse a causa dell’usura masticatoria o delle lesioni ^7,8. Chiarire i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali dentali è quindi fondamentale per comprendere la rigenerazione dentale, un’area di crescente interesse.

Anatomicamente, gran parte dell’incisivo del topo adulto è racchiuso nell’osso mascellare. Mentre il bordo incisale del dente è esposto, l’estremità apicale dell’incisivo si inserisce all’interno di una presa ed è saldamente attaccata all’osso circostante attraverso i legamenti parodontali e i tessuti connettivi (Figura 1A,B). L’estremità apicale dell’incisivo è anche la regione di crescita del dente e mantiene le cellule staminali dentali e progenitrici sia nello strato epiteliale che nella polpa mesenchimale 9,10,11,12,13. In particolare, le cellule staminali epiteliali dentali sono mantenute all’estremità bulbosa dell’epitelio, nota come gemma apicale, nota anche come ansa cervicale labiale (Figura 1C). Analogamente all’epitelio intestinale e all’epidermide, il rinnovamento epiteliale nell’incisivo è supportato principalmente dalle cellule staminali a ciclo attivo e dai loro discendenti intermedi altamente proliferativi, chiamati cellule di amplificazione del transito 14,15,16,17, entrambe residenti nella parte interna dell’ansa cervicale. Tuttavia, resta da determinare se l’epitelio incisivo contenga e utilizzi cellule staminali quiescenti durante la rigenerazione. Al contrario, nella polpa apicale sono state identificate cellule staminali mesenchimali dentali attive e quiescenti e le cellule staminali quiescenti funzionano come una popolazione di riserva che si attiva durante la riparazione della lesione^13,18.

Molte delle scoperte sulla biologia del rinnovamento e della rigenerazione degli incisivi del topo sono il risultato di indagini istologiche, in cui i campioni vengono ottenuti in giunture temporali distinte, fissati, processati e quindi sezionati in fette sottili come un micron lungo un particolare piano. Attraverso un’analisi dettagliata delle sezioni istologiche di diversi modelli murini che consentono il tracciamento del lignaggio o delle perturbazioni genetiche, gli scienziati hanno identificato i lignaggi cellulari di diverse popolazioni di progenitori, nonché le vie genetiche e di segnalazione che controllano l’omeostasi degli incisivi e la riparazione delle lesioni 19,20,21. Tuttavia, le immagini statiche bidimensionali (2D) di cellule non vitali in sezioni non possono catturare l’intero spettro dei comportamenti cellulari e delle organizzazioni spaziali nei tessuti viventi, come i cambiamenti di forma delle cellule, i movimenti e la cinetica cellulare. Rilevare e misurare questi rapidi cambiamenti cellulari, che si verificano su una scala temporale che non è risolvibile attraverso il sezionamento dei tessuti, richiede una strategia diversa. Inoltre, l’acquisizione di tali informazioni è fondamentale anche per comprendere come le cellule dentali interagiscono tra loro, reagiscono a diversi stimoli di segnalazione e si auto-organizzano per mantenere le strutture e le funzioni dei tessuti.

L’avvento dell’imaging dei tessuti profondi a quattro dimensioni (4D) utilizzando la microscopia a due fotoni²², una tecnologia che integra tre dimensioni spaziali con la risoluzione temporale, supera i limiti intrinseci dell’analisi istologica consentendo l’esame spazio-temporale di espianti di tessuti in coltura, organoidi o persino tessuti in situ 23,24,25,26 . Ad esempio, l’imaging dal vivo 4D dell’epitelio dentale in via di sviluppo ha svelato i modelli spazio-temporali delle divisioni e delle migrazioni cellulari che coordinano la crescita dei tessuti, la formazione del centro di segnalazione e la morfogenesi dell’epitelio dentale 27,28,29,30,31,32. Nell’incisivo di topo adulto, l’imaging 4D è stato recentemente adattato per studiare i comportamenti cellulari durante la riparazione del danno epiteliale dentale. L’imaging dal vivo ha rivelato che le cellule intermedie dello strato soprabasale possono essere convertite direttamente in ameloblasti nello strato basale per rigenerare l’epitelio danneggiato, sfidando il paradigma tradizionale della riparazione del danno epiteliale¹⁵.

Qui, descriviamo la dissezione, la coltura e l’imaging dell’incisivo di topo adulto, concentrandoci sulle cellule epiteliali nell’ansa cervicale labiale (Figura 1). Questa tecnica preserva la vitalità delle cellule dentali per più di 12 ore e consente il monitoraggio in tempo reale delle cellule marcate con fluorescenza con una risoluzione a singola cellula. Questo approccio consente di studiare il movimento e la migrazione delle cellule, nonché i cambiamenti dinamici nella forma delle cellule e nell’orientamento della divisione in condizioni di coltura normali o in risposta a perturbazioni genetiche, fisiche e chimiche.

Protocol

Tutti i topi sono stati mantenuti in strutture per animali prive di agenti patogeni presso l’Università della California di Los Angeles (UCLA) o l’Università Ebraica di Gerusalemme (HUJI). Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto i topi sono stati eseguiti secondo le normative e i protocolli approvati dal rispettivo Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). Un flusso di lavoro generale delle fasi sperimentali è mostrato nella Fi…

Representative Results

La regione apicale dell’incisivo del topo adulto è racchiusa all’interno della mandibola (Figura 1) e quindi non è direttamente accessibile per visualizzare e seguire in tempo reale le cellule progenitrici che risiedono all’interno della regione di crescita. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo per estrarre l’intero incisivo dall’osso mascellare e mantenerlo in un sistema di coltura di espianto per la microscopia timelapse a due fotoni (Figura 2). Qui descri…

Discussion

L’imaging di tessuti vivi è una tecnica importante che ci permette di studiare i processi dinamici e i comportamenti delle cellule quando vengono mantenute nel loro ambiente di nicchia⁴¹. Idealmente, l’imaging dal vivo viene eseguito in vivo con un’elevata risoluzione spazio-temporale. Tuttavia, l’imaging in vivo per gli organi dei mammiferi può essere difficile a causa dell’inaccessibilità dei tessuti, dell’opacità ottica e della difficoltà di immobilizzare l’animale o l’or…

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09