Utilisation de l’imagerie en direct ex vivo pour étudier les divisions et les mouvements cellulaires au cours du renouvellement dentaire de la souris

Summary

L’imagerie en direct ex vivo est une technique puissante pour étudier les processus dynamiques des mouvements et des interactions cellulaires dans les tissus vivants. Nous présentons ici un protocole qui met en œuvre la microscopie à deux photons pour suivre en direct les cellules épithéliales dentaires dans des incisives de souris adultes entières en culture.

Abstract

L’incisive de souris, qui ne cesse de croître, est en train de devenir un système modèle très facile à traiter pour étudier la régulation des cellules souches épithéliales et mésenchymateuses adultes et la régénération des dents. Ces populations progénitrices se divisent, se déplacent et se différencient activement pour maintenir l’homéostasie tissulaire et régénérer les cellules perdues de manière réactive. Cependant, les analyses traditionnelles utilisant des coupes de tissus fixes n’ont pas pu capturer les processus dynamiques des mouvements et des interactions cellulaires, ce qui limite notre capacité à étudier leurs régulations. Cet article décrit un protocole permettant de maintenir des incisives de souris entières dans un système de culture d’explants et de suivre en direct des cellules épithéliales dentaires à l’aide de la microscopie timelapse multiphotonique. Cette technique s’ajoute à notre boîte à outils existante pour la recherche dentaire et permet aux chercheurs d’acquérir des informations spatio-temporelles sur les comportements et les organisations cellulaires dans un tissu vivant. Nous prévoyons que cette méthodologie aidera les chercheurs à explorer davantage les mécanismes qui contrôlent les processus cellulaires dynamiques qui se déroulent à la fois pendant le renouvellement et la régénération dentaires.

Introduction

Au cours des deux dernières décennies, l’incisive de souris s’est imposée comme une plate-forme inestimable pour étudier les principes de la régulation des cellules souches adultes et de la régénération des dents ^1,2. L’incisive de la souris grandit continuellement et se renouvelle tout au long de la vie de l’animal. Pour ce faire, il maintient à la fois les cellules souches épithéliales et mésenchymateuses, qui peuvent s’auto-renouveler et se différencier en différents types de cellules de la dent ^1,2. Alors que les cellules souches épithéliales dentaires donnent naissance aux améloblastes, qui sécrètent la matrice de l’émail, les cellules souches mésenchymateuses dentaires donnent naissance aux odontoblastes, aux cémentoblastes et aux fibroblastes, qui forment respectivement la dentine, le cément et le ligament parodontal,^{respectivement} 3,4,5,6. Cet apport constant de nouvelles cellules maintient l’homéostasie tissulaire et permet le remplacement des vieilles cellules perdues en raison de l’usure masticatoire ou de blessures ^7,8. L’élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent le maintien et la différenciation des cellules souches dentaires est donc au cœur de la compréhension de la régénération dentaire, un domaine d’intérêt croissant.

Anatomiquement, une grande partie de l’incisive de la souris adulte est enfermée dans l’os de la mâchoire. Alors que le bord incisif de la dent est exposé, l’extrémité apicale de l’incisive s’insère dans une alvéole et est fermement attachée à l’os environnant par les ligaments parodontaux et les tissus conjonctifs (Figure 1A,B). L’extrémité apicale de l’incisive est également la région de croissance de la dent et maintient les cellules souches dentaires et progénitrices à la fois dans la couche épithéliale et la pulpe mésenchymateuse 9,10,11,12,13. Plus précisément, les cellules souches épithéliales dentaires sont maintenues à l’extrémité bulbeuse de l’épithélium, connue sous le nom de bourgeon apical, également appelé anse cervicale labiale (Figure 1C). À l’instar de l’épithélium intestinal et de l’épiderme, le renouvellement épithélial de l’incisive est principalement soutenu par des cellules souches à cycle actif et leurs descendants intermédiaires hautement prolifératifs, appelés cellules amplificatrices du transit 14,15,16,17, toutes deux résidant dans la partie interne de l’anse cervicale. Cependant, il reste à déterminer si l’épithélium incisif contient et utilise des cellules souches quiescentes pendant la régénération. En revanche, des cellules souches mésenchymateuses dentaires actives et quiescentes ont été identifiées dans la pulpe apicale, et les cellules souches quiescentes fonctionnent comme une population de réserve qui s’active lors de la réparation des blessures^13,18.

De nombreuses découvertes sur la biologie du renouvellement et de la régénération des incisives de souris ont résulté d’études histologiques, dans lesquelles des échantillons sont obtenus à des jonctions temporelles distinctes, fixés, traités, puis sectionnés en tranches d’une épaisseur de l’ordre du micron le long d’un plan particulier. Grâce à une analyse détaillée des coupes histologiques de différents modèles murins qui permettent de tracer la lignée ou les perturbations génétiques, les scientifiques ont identifié les lignées cellulaires de différentes populations progénitrices, ainsi que les voies génétiques et de signalisation qui contrôlent l’homéostasie des incisives et la réparation des blessures 19,20,21. Cependant, les images statiques bidimensionnelles (2D) de cellules non vitales en coupes ne peuvent pas capturer le spectre complet des comportements cellulaires et des organisations spatiales dans les tissus vivants, tels que les changements de forme cellulaire, les mouvements et la cinétique cellulaire. La détection et la mesure de ces changements cellulaires rapides, qui se produisent à une échelle de temps qui ne peut être résolue par la section des tissus, nécessitent une stratégie différente. De plus, l’acquisition de ces informations est également essentielle pour comprendre comment les cellules dentaires interagissent les unes avec les autres, réagissent à différents stimuli de signalisation et s’auto-organisent pour maintenir les structures et les fonctions des tissus.

L’avènement de l’imagerie quadridimensionnelle (4D) des tissus profonds à l’aide de la microscopie à deux photons²², une technologie qui intègre trois dimensions spatiales avec une résolution temporelle, permet de surmonter les limites inhérentes à l’analyse histologique en permettant l’examen spatio-temporel d’explants de tissus cultivés, d’organoïdes ou même de tissus in situ 23,24,25,26 . Par exemple, l’imagerie 4D en direct de l’épithélium dentaire en développement a révélé les modèles spatio-temporels des divisions et des migrations cellulaires qui coordonnent la croissance des tissus, la formation du centre de signalisation et la morphogenèse épithéliale dentaire 27,28,29,30,31,32. Dans l’incisive de la souris adulte, l’imagerie 4D a été récemment adaptée pour étudier les comportements cellulaires lors de la réparation des lésions épithéliales dentaires. L’imagerie en direct a révélé que les cellules de la couche intermédiaire de la couche suprabasale peuvent être directement converties en améloblastes dans la couche basale pour régénérer l’épithélium endommagé, remettant en question le paradigme traditionnel de la réparation des lésions épithéliales¹⁵.

Ici, nous décrivons la dissection, la culture et l’imagerie de l’incisive de souris adulte, en nous concentrant sur les cellules épithéliales de l’anse cervicale labiale (Figure 1). Cette technique préserve la vitalité des cellules dentaires pendant plus de 12 h et permet de suivre en direct les cellules marquées par fluorescence à une résolution unicellulaire. Cette approche permet d’étudier le mouvement et la migration des cellules ainsi que les changements dynamiques de la forme et de l’orientation de la division cellulaire dans des conditions normales de culture, ou en réponse à des perturbations génétiques, physiques et chimiques.

Protocol

Toutes les souris ont été maintenues dans des animaleries exemptes d’agents pathogènes à l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA) ou à l’Université hébraïque de Jérusalem (HUJI). Toutes les expériences impliquant des souris ont été réalisées conformément aux règlements et aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) (ARC-2019-013 ; UCLA) ou (MD-23-17184-3 ; HUJI). Un déroulement général des étapes expérimentales est illu…

Representative Results

La région apicale de l’incisive de la souris adulte est enfermée dans la mandibule (Figure 1) et, par conséquent, n’est pas directement accessible pour visualiser et suivre en direct les cellules progénitrices résidant dans la région de croissance. Par conséquent, nous avons développé une méthode pour extraire l’incisive entière de l’os de la mâchoire et la maintenir dans un système de culture d’explants pour la microscopie timelapse à deux photons (<strong class="xfi…

Discussion

L’imagerie des tissus vivants est une technique importante qui nous permet d’étudier les processus dynamiques et les comportements des cellules lorsqu’elles sont maintenues dans leur environnement de niche⁴¹. Idéalement, l’imagerie en direct est réalisée in vivo avec une haute résolution spatio-temporelle. Cependant, l’imagerie in vivo des organes de mammifères peut être difficile en raison de l’inaccessibilité des tissus, de l’opacité optique et de la diff…

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09