माउस दंत नवीकरण के दौरान सेल डिवीजनों और आंदोलनों की जांच करने के लिए पूर्व विवो लाइव इमेजिंग का उपयोग करना
Summary
पूर्व विवो लाइव इमेजिंग जीवित ऊतकों में सेलुलर आंदोलनों और बातचीत की गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो सुसंस्कृत पूरे वयस्क माउस incenders में दंत उपकला कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी को लागू करता है।
Abstract
लगातार बढ़ते माउस छेदक वयस्क उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं और दांत पुनर्जनन के नियमन की जांच करने के लिए एक अत्यधिक ट्रैक्टेबल मॉडल प्रणाली के रूप में उभर रहा है। ये पूर्वज आबादी ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और एक उत्तरदायी तरीके से खोई हुई कोशिकाओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए सक्रिय रूप से विभाजित, स्थानांतरित और अंतर करती है। हालांकि, निश्चित ऊतक वर्गों का उपयोग करके पारंपरिक विश्लेषण सेलुलर आंदोलनों और इंटरैक्शन की गतिशील प्रक्रियाओं को पकड़ नहीं सके, जिससे उनके नियमों का अध्ययन करने की हमारी क्षमता सीमित हो गई। यह पत्र एक एक्सप्लांट कल्चर सिस्टम में पूरे माउस incenders को बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और मल्टीफोटन टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके डेंटल एपिथेलियल कोशिकाओं को लाइव-ट्रैक करता है। यह तकनीक दंत चिकित्सा अनुसंधान के लिए हमारे मौजूदा टूलबॉक्स में जोड़ती है और जांचकर्ताओं को एक जीवित ऊतक में सेल व्यवहार और संगठनों पर स्थानिक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देती है। हम आशा करते हैं कि यह पद्धति शोधकर्ताओं को उन तंत्रों का पता लगाने में मदद करेगी जो दंत नवीकरण और उत्थान दोनों के दौरान होने वाली गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करते हैं।
Introduction
पिछले दो दशकों में, माउस छेदनी वयस्क स्टेम सेल विनियमन और दांत पुनर्जनन 1,2 के सिद्धांतों की जांच के लिए एक अमूल्य मंच के रूप में उभरा है. माउस छेनी लगातार बढ़ता है और जानवर के जीवन भर खुद को नवीनीकृत करता है। यह दोनों उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं, जो स्वयं को नवीनीकृत और दांत 1,2 के विभिन्न सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं बनाए रखने के द्वारा ऐसा करता है. जबकि दंत उपकला स्टेम सेल अमेलोब्लास्ट्स को जन्म देते हैं, जो तामचीनी मैट्रिक्स का स्राव करते हैं, दंत मेसेनकाइमल स्टेम सेल ओडोंटोब्लास्ट्स, सीमेंटोब्लास्ट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स को जन्म देते हैं, जो क्रमशःडेंटिन, सीमेंटम और पीरियडोंटल लिगामेंट बनाते हैं, क्रमशः 3,4,5,6. नई कोशिकाओं की यह निरंतर आपूर्ति ऊतक होमियोस्टेसिस को बनाए रखती है और पुरानी कोशिकाओं के प्रतिस्थापन की अनुमति देती है जो मैस्टिक पहनने या चोटों के कारण खो जाती हैं 7,8. सेलुलर और आणविक तंत्र है कि रखरखाव और दंत स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को विनियमित इसलिए दंत उत्थान को समझने के लिए केंद्रीय है, बढ़ती ब्याज का एक क्षेत्र.
शारीरिक रूप से, वयस्क माउस छेनी का एक बड़ा हिस्सा जबड़े की हड्डी में संलग्न है। जबकि दांत के चीरा किनारे को उजागर किया जाता है, छेनी का शिखर अंत एक सॉकेट के भीतर फिट बैठता है और पीरियडोंटल स्नायुबंधन और संयोजी ऊतकों(चित्रा 1ए,बी)के माध्यम से आसपास की हड्डी से मजबूती से जुड़ा होता है। छेनी के शिखर अंत भी दांत के विकास क्षेत्र है और दोनों उपकला परत और mesenchymal लुगदी 9,10,11,12,13 में दंत स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं को बनाए रखता है. विशेष रूप से, दंत उपकला स्टेम कोशिकाओं को उपकला के बल्बनुमा अंत में बनाए रखा जाता है, जिसे एपिकल कली के रूप में जाना जाता है, जिसे लैबियल ग्रीवा पाश(चित्रा 1सी)के रूप में भी जाना जाता है। आंतों के उपकला और एपिडर्मिस के समान, छेनी में उपकला नवीकरण मुख्य रूप से सक्रिय रूप से साइकिल चालन स्टेम कोशिकाओं और उनके अत्यधिक प्रोलिफेरेटिव मध्यवर्ती वंशज, पारगमन-प्रवर्धक कोशिकाओं 14,15,16,17 कहा जाता है, दोनों गर्भाशय ग्रीवा पाश के भीतरी भाग में रहने द्वारा समर्थित है. हालांकि, क्या incisor उपकला शामिल है और उत्थान के दौरान मौन स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करता है निर्धारित किया जा करने के लिए बनी हुई है. इसके विपरीत, दोनों सक्रिय और मौन दंत मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को शिखर लुगदी में पहचाना गया है, और मौन स्टेम सेल एक आरक्षित आबादी के रूप में कार्य करते हैं जो चोट की मरम्मत13,18 के दौरान सक्रिय हो जाता है।
माउस छेनी नवीकरण और उत्थान के जीव विज्ञान पर खोजों में से कई ऊतकीय जांच से हुई है, जिसमें नमूने अलग-अलग लौकिक जंक्शनों पर प्राप्त किए जाते हैं, तय, संसाधित, और फिर एक विशेष विमान के साथ माइक्रोन-पतली स्लाइस में खंडित होते हैं। विभिन्न माउस मॉडल से हिस्टोलॉजिकल वर्गों के विस्तृत विश्लेषण के माध्यम से जो वंश अनुरेखण या आनुवंशिक गड़बड़ी को सक्षम करते हैं, वैज्ञानिकों ने विभिन्न पूर्वज आबादी के सेल वंशावली की पहचान की है, साथ ही आनुवंशिक और सिग्नलिंग रास्ते जो छेनी होमियोस्टेसिस और चोट की मरम्मत 19,20,21 को नियंत्रित करते हैं. हालांकि, वर्गों में गैर-महत्वपूर्ण कोशिकाओं की स्थिर दो-आयामी (2 डी) छवियां जीवित ऊतक में सेलुलर व्यवहार और स्थानिक संगठनों के पूर्ण स्पेक्ट्रम पर कब्जा नहीं कर सकती हैं, जैसे सेल आकार परिवर्तन, आंदोलनों और सेलुलर कैनेटीक्स। इन तेजी से सेलुलर परिवर्तनों का पता लगाना और मापना, जो एक टाइमस्केल पर होते हैं जो ऊतक सेक्शनिंग के माध्यम से अनसुलझे होते हैं, एक अलग रणनीति की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, ऐसी जानकारी प्राप्त करना यह समझने के लिए भी महत्वपूर्ण है कि दंत कोशिकाएं एक-दूसरे के साथ कैसे बातचीत करती हैं, विभिन्न सिग्नलिंग उत्तेजनाओं पर प्रतिक्रिया करती हैं, और ऊतक संरचनाओं और कार्यों को बनाए रखने के लिए आत्म-व्यवस्थित होती हैं।
दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी22 का उपयोग करके चार-आयामी (4 डी) गहरी ऊतक इमेजिंग का आगमन, एक ऐसी तकनीक जो लौकिक संकल्प के साथ तीन स्थानिक आयामों को एकीकृत करती है, सुसंस्कृत ऊतक प्रत्यारोपण, ऑर्गेनोइड्स, या यहां तक कि ऊतकों की स्थानिक परीक्षा को सक्षम करके हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण की अंतर्निहित सीमाओं पर काबू पाती है. उदाहरण के लिए, विकासशील दांत उपकला के 4 डी लाइव इमेजिंग ने कोशिका विभाजन और माइग्रेशन के स्थानिक पैटर्न का अनावरण किया है जो ऊतक विकास, सिग्नलिंग सेंटर गठन और दंत उपकला मोर्फोजेनेसिस 27,28,29,30,31,32 का समन्वय करते हैं . वयस्क माउस छेनी में, 4 डी इमेजिंग हाल ही में दंत उपकला चोट की मरम्मत के दौरान सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है. लाइव इमेजिंग suprabasal परत में स्ट्रेटम intermedium कोशिकाओं सीधे क्षतिग्रस्त उपकला पुनर्जीवित करने के लिए बेसल परत में ameloblasts में परिवर्तित किया जा सकता है, उपकला चोट की मरम्मत15 के पारंपरिक प्रतिमान को चुनौती.
यहां, हम वयस्क माउस छेनी के विच्छेदन, संवर्धन और इमेजिंग का वर्णन करते हैं, जो प्रयोगशाला ग्रीवा पाश(चित्रा 1)में उपकला कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करते हैं। यह तकनीक 12 घंटे से अधिक के लिए दंत कोशिका जीवन शक्ति को संरक्षित करती है और एकल-कोशिका संकल्प पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं की लाइव ट्रैकिंग की अनुमति देती है। यह दृष्टिकोण सेल गति और प्रवास की जांच के साथ-साथ सामान्य संस्कृति स्थितियों के तहत सेल आकार और विभाजन अभिविन्यास में गतिशील परिवर्तन, या आनुवंशिक, भौतिक और रासायनिक गड़बड़ी के जवाबों में अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लाइव ऊतक इमेजिंग एक महत्वपूर्ण तकनीक है जो हमें कोशिकाओं की गतिशील प्रक्रियाओं और व्यवहारों का अध्ययन करने की अनुमति देती है जब उन्हें उनके आला वातावरण में बनाए रखा जाता है41. आदर्श रूप से, लाइ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया नैनोसिस्टम्स इंस्टीट्यूट (RRID: SCR_022789) में UCLA एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी / स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगशाला और लीका माइक्रोसिस्टम्स सेंटर ऑफ एक्सीलेंस को स्वीकार करते हैं। एएस को इज़राइल साइंस फाउंडेशन से आईएसएफ 604-21 द्वारा समर्थित किया गया था। जेएच को एनआईएच/एनआईडीसीआर के R03DE030205 और R01DE030471 का समर्थन प्राप्त था। एएस और जेएच को संयुक्त राज्य अमेरिका-इज़राइल बिनेशनल साइंस फाउंडेशन (बीएसएफ) से अनुदान 2021007 द्वारा भी समर्थित किया गया था।
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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