Bruke Ex Vivo Live Imaging for å undersøke celledelinger og bevegelser under fornyelse av musetenner

Summary

Ex vivo live imaging er en kraftig teknikk for å studere de dynamiske prosessene for cellulære bevegelser og interaksjoner i levende vev. Her presenterer vi en protokoll som implementerer to-foton mikroskopi for å live spore tannepitelceller i dyrkede hele voksne musefortenner.

Abstract

Den kontinuerlig voksende musesnittet fremstår som et svært håndterbart modellsystem for å undersøke reguleringen av voksne epitel- og mesenkymale stamceller og tannregenerering. Disse stampopulasjonene deler seg aktivt, beveger seg og differensierer for å opprettholde vevshomeostase og regenerere tapte celler på en responsiv måte. Tradisjonelle analyser ved hjelp av faste vevssnitt kunne imidlertid ikke fange opp de dynamiske prosessene i cellulære bevegelser og interaksjoner, noe som begrenset vår evne til å studere regelverket. Dette papiret beskriver en protokoll for å opprettholde hele musesnitt i et eksplantekultursystem og live-track dental epitelceller ved hjelp av multifoton timelapse-mikroskopi. Denne teknikken legger til vår eksisterende verktøykasse for tannforskning og gjør det mulig for etterforskere å skaffe seg spatiotemporal informasjon om celleadferd og organisasjoner i et levende vev. Vi forventer at denne metoden vil hjelpe forskere videre å utforske mekanismer som styrer de dynamiske cellulære prosessene som foregår under både tannfornyelse og regenerering.

Introduction

I løpet av de siste to tiårene har musesnittet dukket opp som en uvurderlig plattform for å undersøke prinsippene for regulering av stamceller hos voksne og tannregenerering ^1,2. Musesnittet vokser kontinuerlig og fornyer seg gjennom hele dyrets liv. Det gjør den ved å opprettholde både epitel- og mesenkymale stamceller, som kan fornye seg og differensiere til forskjellige celletyper av tannen ^1,2. Mens dental epitelial stamceller gir opphav til ameloblaster, som skiller ut emaljematrisen, dental mesenkymale stamceller gir opphav til odontoblaster, sementoblaster og fibroblaster, som danner dentin, sementum og periodontalt ligament, henholdsvis 3,4,5,6. Denne konstante tilførselen av nye celler opprettholder vevshomeostase og tillater erstatning av gamle celler som går tapt på grunn av masticatory slitasje eller skader ^7,8. Å belyse de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer vedlikehold og differensiering av dentale stamceller er derfor sentralt for å forstå tannregenerering, et område av økende interesse.

Anatomisk er en stor del av den voksne musesnittet innkapslet i kjevebenet. Mens snittkanten av tannen er eksponert, passer den apikale enden av fortennen i en sokkel og er godt festet til det omkringliggende beinet gjennom periodontale leddbånd og bindevev (figur 1A,B). Fortennens apikale ende er også tannens vekstområde og opprettholder tannstamme- og stamceller i både epitellaget og mesenkymalmassen 9,10,11,12,13. Spesielt opprettholdes dental epitelial stamceller ved den pæreformede enden av epitelet, kjent som den apikale knoppen, også referert til som labial cervical loop (figur 1C). I likhet med tarmepitelet og epidermis støttes epitelfornyelse i snittet primært av aktivt syklende stamceller og deres svært proliferative mellomliggende etterkommere, kalt transittforsterkende celler 14,15,16,17, begge bosatt i den indre delen av livmorhalsløkken. Men om snittepitelet inneholder og benytter hvilende stamceller under regenerering, gjenstår å bli bestemt. I motsetning til dette har både aktive og hvilende dental mesenkymale stamceller blitt identifisert i den apikale massen, og de hvilende stamcellene fungerer som en reservepopulasjon som blir aktivert under skadereparasjon^13,18.

Mange av funnene på biologien til musesnittets fornyelse og regenerering har resultert fra histologiske undersøkelser, hvor prøver oppnås ved forskjellige temporale knutepunkter, fast, behandlet og deretter seksjonert i mikrontynne skiver langs et bestemt plan. Gjennom detaljert analyse av histologiske seksjoner fra forskjellige musemodeller som muliggjør avstamningssporing eller genetiske forstyrrelser, har forskere identifisert cellelinjene til forskjellige stampopulasjoner, samt de genetiske og signalveiene som styrer snitthomeostase og skadereparasjon 19,20,21. Imidlertid kan de statiske todimensjonale (2D) bildene av ikke-vitale celler i seksjoner ikke fange hele spekteret av cellulær atferd og romlige organisasjoner i levende vev, for eksempel celleformendringer, bevegelser og cellulær kinetikk. Å oppdage og måle disse raske cellulære endringene, som skjer i en tidsskala som ikke kan løses gjennom vevsseksjonering, krever en annen strategi. Videre er innhenting av slik informasjon også kritisk for å forstå hvordan tannceller samhandler med hverandre, reagerer på forskjellige signalstimuli og selvorganiserer for å opprettholde vevstrukturer og funksjoner.

Fremkomsten av firedimensjonal (4D) dypvevsavbildning ved hjelp av to-foton mikroskopi²², en teknologi som integrerer tre romlige dimensjoner med tidsmessig oppløsning, overvinner de iboende begrensningene i histologisk analyse ved å muliggjøre spatiotemporal undersøkelse av dyrkede vevseksplanter, organoider eller til og med vev in situ 23,24,25,26 . For eksempel har 4D live imaging av det utviklende tannepitelet avdekket de spatiotemporale mønstrene av celledelinger og migrasjoner som koordinerer vevsvekst, signalsenterdannelse og dental epitelial morfogenese 27,28,29,30,31,32 . I den voksne musen incisor, har 4D-bildebehandling nylig blitt tilpasset for å studere cellulær atferd under dental epitel skade reparasjon. Live imaging avslørte at stratum intermediumceller i det suprabasale laget kan omdannes direkte til ameloblaster i basallaget for å regenerere det skadede epitelet, og utfordrer det tradisjonelle paradigmet for epitelskadereparasjon¹⁵.

Her beskriver vi disseksjon, dyrkning og avbildning av den voksne musefortennennene, med fokus på epitelceller i labial cervikalsløyfe (figur 1). Denne teknikken bevarer tanncellenes vitalitet i mer enn 12 timer og tillater live sporing av fluorescerende merkede celler ved enkeltcelleoppløsning. Denne tilnærmingen tillater undersøkelse av cellebevegelse og migrasjon, samt dynamiske endringer i celleform og delingsorientering under normale kulturforhold, eller som svar på genetiske, fysiske og kjemiske forstyrrelser.

Protocol

Alle mus ble vedlikeholdt i patogenfrie dyrefasiliteter ved University of California Los Angeles (UCLA) eller Det hebraiske universitetet i Jerusalem (HUJI). Alle eksperimenter med mus ble utført i henhold til forskrifter og protokoller godkjent av den respektive Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) eller (MD-23-17184-3; HUJI). En generell arbeidsflyt for de eksperimentelle trinnene er vist i figur 2A. Se materialfortegnelsen for detaljer…

Representative Results

Den apikale regionen av den voksne musefortennen er innkapslet i mandibelen (figur 1) og er derfor ikke direkte tilgjengelig for å visualisere og live-spore stamcellene som bor i vekstregionen. Derfor har vi utviklet en metode for å trekke ut hele fortennen fra kjevebenet og vedlikeholde den i et eksplantdyrkningssystem for to-foton timelapsemikroskopi (figur 2). Her beskriver vi representative resultater som fanger den dynamiske prosessen med celleproliferasj…

Discussion

Levende vevsavbildning er en viktig teknikk som gjør at vi kan studere cellens dynamiske prosesser og atferd når de opprettholdes i sitt nisjemiljø⁴¹. Ideelt sett utføres live imaging in vivo med høy spatiotemporal oppløsning. Imidlertid kan in vivo-avbildning for pattedyrs organer være utfordrende på grunn av vevsutilgjengelighet, optisk ugjennomsiktighet og vanskeligheter med å immobilisere dyret eller organet i en lengre periode⁴². Vevseksplant…

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09