Användning av Ex Vivo Live Imaging för att undersöka celldelningar och rörelser under tandförnyelse hos möss

Summary

Ex vivo live imaging är en kraftfull teknik för att studera de dynamiska processerna för cellulära rörelser och interaktioner i levande vävnader. Här presenterar vi ett protokoll som implementerar tvåfotonmikroskopi för att spåra tandepitelceller i odlade hela vuxna musframtänder.

Abstract

Den ständigt växande musframtanden håller på att växa fram som ett mycket lätthanterligt modellsystem för att undersöka regleringen av vuxna epitelceller och mesenkymala stamceller och tandregenerering. Dessa stamcellspopulationer delar sig aktivt, flyttar och differentierar för att upprätthålla vävnadshomeostas och regenerera förlorade celler på ett lyhört sätt. Traditionella analyser med fasta vävnadssnitt kunde dock inte fånga de dynamiska processerna i cellulära rörelser och interaktioner, vilket begränsade vår förmåga att studera deras regleringar. Denna artikel beskriver ett protokoll för att upprätthålla hela musframtänder i ett explantodlingssystem och levande tandepitelceller med hjälp av multifotontimelapse-mikroskopi. Denna teknik kompletterar vår befintliga verktygslåda för dentalforskning och gör det möjligt för utredare att få spatiotemporal information om cellbeteenden och organisationer i en levande vävnad. Vi förväntar oss att denna metodik kommer att hjälpa forskare att ytterligare utforska mekanismer som styr de dynamiska cellulära processer som äger rum under både tandförnyelse och regenerering.

Introduction

Under de senaste två decennierna har musframtänderna vuxit fram som en ovärderlig plattform för att undersöka principerna för reglering av vuxna stamceller och tandregenerering ^1,2. Musens framtand växer kontinuerligt och förnyar sig under hela djurets liv. Det gör det genom att upprätthålla både epitel- och mesenkymala stamceller, som kan förnya sig själva och differentiera till olika celltyper i tanden ^1,2. Medan dentala epitelstamceller ger upphov till ameloblaster, som utsöndrar emaljmatrisen, ger dentala mesenkymala stamceller upphov till odontoblaster, cementoblaster och fibroblaster, som bildar dentin, cement respektive parodontala ligament, 3,4,5,6. Denna konstanta tillförsel av nya celler upprätthåller vävnadshomeostas och gör det möjligt att ersätta gamla celler som går förlorade på grund av tuggslitage eller skador ^7,8. Att belysa de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar underhåll och differentiering av tandstamceller är därför centralt för att förstå tandregenerering, ett område av växande intresse.

Anatomiskt sett är en stor del av framtänderna hos vuxna möss inneslutna i käkbenet. Medan tandens snittkant är exponerad, passar framtandens apikala ände i ett uttag och är ordentligt fäst vid det omgivande benet genom parodontala ligament och bindväv (Figur 1A,B). Framtandens apikala ände är också tandens tillväxtområde och upprätthåller tandstams- och stamceller i både epitelskiktet och den mesenkymala pulpan 9,10,11,12,13. Specifikt upprätthålls dentala epitelstamceller i den bulliga änden av epitelet, känd som den apikala knoppen, även kallad den labiala cervikala slingan (Figur 1C). I likhet med tarmepitelet och epidermis stöds epitelförnyelsen i framtänderna främst av aktivt cirkulerande stamceller och deras mycket proliferativa mellanliggande ättlingar, kallade transitförstärkande celler 14,15,16,17, båda belägna i den inre delen av livmoderhalsslingan. Huruvida framtändernas epitel innehåller och använder vilande stamceller under regenereringen återstår dock att fastställa. Däremot har både aktiva och vilande dentala mesenkymala stamceller identifierats i den apikala pulpan, och de vilande stamcellerna fungerar som en reservpopulation som aktiveras under skadeläkning^13,18.

Många av upptäckterna om biologin bakom förnyelse och regenerering av framtänder hos möss har varit resultatet av histologiska undersökningar, där prover tas vid distinkta tidsmässiga tidpunkter, fixeras, bearbetas och sedan delas upp i mikrontunna skivor längs ett visst plan. Genom detaljerad analys av histologiska sektioner från olika musmodeller som möjliggör härstamningsspårning eller genetiska störningar har forskare identifierat cellinjerna för olika stamcellspopulationer, såväl som de genetiska och signalvägar som styr framtändernas homeostas och skadereparation 19,20,21. De statiska tvådimensionella (2D) bilderna av icke-vitala celler i snitt kan dock inte fånga hela spektrumet av cellulära beteenden och rumsliga organisationer i levande vävnad, såsom cellformförändringar, rörelser och cellulär kinetik. Att upptäcka och mäta dessa snabba cellulära förändringar, som sker på en tidsskala som inte går att lösa genom vävnadssnittning, kräver en annan strategi. Dessutom är det också viktigt att skaffa sådan information för att förstå hur tandceller interagerar med varandra, reagerar på olika signalstimuli och självorganiserar sig för att upprätthålla vävnadsstrukturer och funktioner.

Tillkomsten av fyrdimensionell (4D) djupvävnadsavbildning med hjälp av tvåfotonmikroskopi²², en teknik som integrerar tre rumsliga dimensioner med tidsupplösning, övervinner de inneboende begränsningarna för histologisk analys genom att möjliggöra spatiotemporal undersökning av odlade vävnadsexplantor, organoider eller till och med vävnader in situ 23,24,25,26 . Till exempel har 4D-liveavbildning av det utvecklande tandepitelet avslöjat de spatiotemporala mönstren för celldelningar och migrationer som samordnar vävnadstillväxt, signalcenterbildning och dentalepitelmorfogenes 27,28,29,30,31,32 . I framtänderna hos vuxna möss har 4D-avbildning nyligen anpassats för att studera cellulära beteenden under reparation av tandepitelskador. Live-avbildning avslöjade att stratumintermediumceller i det suprabasala skiktet direkt kan omvandlas till ameloblaster i basalskiktet för att regenerera det skadade epitelet, vilket utmanar det traditionella paradigmet för reparation av epitelskador¹⁵.

Här beskriver vi dissektion, odling och avbildning av framtänderna hos vuxna möss, med fokus på epitelceller i den labiala cervikala slingan (Figur 1). Denna teknik bevarar tandcellernas vitalitet i mer än 12 timmar och möjliggör livespårning av fluorescerande märkta celler med encellsupplösning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att undersöka cellrörelser och migration samt dynamiska förändringar i cellform och delningsorientering under normala odlingsförhållanden, eller som svar på genetiska, fysiska och kemiska störningar.

Protocol

Alla möss hölls i patogenfria djuranläggningar vid University of California Los Angeles (UCLA) eller Hebrew University of Jerusalem (HUJI). Alla försök på möss utfördes i enlighet med regler och protokoll som godkänts av respektive Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) eller (MD-23-17184-3; HUJI). Ett allmänt arbetsflöde för de experimentella stegen visas i figur 2A. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla instrum…

Representative Results

Den apikala regionen av den vuxna musens framtand är innesluten i underkäken (figur 1) och är därför inte direkt tillgänglig för visualisering och live-spårning av stamcellerna som finns i tillväxtregionen. Därför har vi utvecklat en metod för att extrahera hela framtanden från käkbenet och behålla den i ett explantodlingssystem för tvåfoton-timelapse-mikroskopi (Figur 2). Här beskriver vi representativa resultat som fångar den dynamiska proce…

Discussion

Levande vävnadsavbildning är en viktig teknik som gör det möjligt för oss att studera cellernas dynamiska processer och beteenden när de underhålls i sin nischmiljö⁴¹. Helst utförs live-avbildning in vivo med hög spatiotemporal upplösning. In vivo-avbildning av däggdjursorgan kan dock vara utmanande på grund av vävnadsotillgänglighet, optisk ogenomskinlighet och svårigheter att immobilisera djuret eller organet under en längre period⁴². V?…

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09