Fare Diş Yenileme Sırasında Hücre Bölünmelerini ve Hareketlerini Araştırmak için Ex Vivo Canlı Görüntülemeyi Kullanma
Summary
Ex vivo canlı görüntüleme, canlı dokulardaki hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini incelemek için güçlü bir tekniktir. Burada, kültürlenmiş tüm yetişkin fare kesici dişlerinde diş epitel hücrelerini canlı izlemek için iki foton mikroskobu uygulayan bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Sürekli büyüyen fare kesici dişi, yetişkin epitelyal ve mezenkimal kök hücrelerin düzenlenmesini ve diş rejenerasyonunu araştırmak için oldukça izlenebilir bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Bu progenitör popülasyonlar, doku homeostazını korumak ve kayıp hücreleri duyarlı bir şekilde yenilemek için aktif olarak bölünür, hareket eder ve farklılaşır. Bununla birlikte, sabit doku kesitlerini kullanan geleneksel analizler, hücresel hareketlerin ve etkileşimlerin dinamik süreçlerini yakalayamadı ve bu da düzenlemelerini inceleme yeteneğimizi sınırladı. Bu makale, bir eksplant kültür sisteminde tüm fare kesici dişlerini korumak ve multifoton timelapse mikroskobu kullanarak canlı diş epitel hücrelerini izlemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu teknik, diş araştırmaları için mevcut araç kutumuza katkıda bulunur ve araştırmacıların canlı bir dokudaki hücre davranışları ve organizasyonları hakkında uzay-zamansal bilgi edinmelerini sağlar. Bu metodolojinin, araştırmacıların hem diş yenilenmesi hem de rejenerasyon sırasında meydana gelen dinamik hücresel süreçleri kontrol eden mekanizmaları daha fazla keşfetmelerine yardımcı olacağını tahmin ediyoruz.
Introduction
Son yirmi yılda, fare kesici dişi, yetişkin kök hücre regülasyonu ve diş rejenerasyonuilkelerini araştırmak için paha biçilmez bir platform olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Fare kesici diş sürekli büyür ve hayvanın yaşamı boyunca kendini yeniler. Bunu, kendi kendini yenileyebilen ve dişin farklı hücre tiplerine farklılaşabilen hem epitelyal hem de mezenkimal kök hücreleri koruyarak yapar 1,2. Dental epitelyal kök hücreler mine matriksini salgılayan ameloblastlara yol açarken, dental mezenkimal kök hücreler sırasıyla dentin, sement ve periodontal ligament oluşturan odontoblastlara, sementoblastlara ve fibroblastlara yol açar 3,4,5,6. Bu sürekli yeni hücre kaynağı, doku homeostazını korur ve çiğneme aşınması veya yaralanmalar nedeniyle kaybedilen eski hücrelerin değiştirilmesine izin verir 7,8. Bu nedenle, dental kök hücrelerin korunmasını ve farklılaşmasını düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaların aydınlatılması, artan bir ilgi alanı olan dental rejenerasyonu anlamanın merkezinde yer almaktadır.
Anatomik olarak, yetişkin fare kesici dişinin büyük bir kısmı çene kemiği ile kaplıdır. Dişin insizal kenarı açıktayken, kesici dişin apikal ucu bir yuvaya oturur ve periodontal ligamentler ve bağ dokuları aracılığıyla çevre kemiğe sıkıca tutunur (Şekil 1A,B). Kesici dişin apikal ucu aynı zamanda dişin büyüme bölgesidir ve hem epitel tabakasında hem de mezenkimal pulpada diş sapı ve progenitör hücreleri korur 9,10,11,12,13. Spesifik olarak, diş epitelyal kök hücreleri, apikal tomurcuk olarak bilinen ve labial servikal döngü olarak da adlandırılan epitelin soğanlı ucunda tutulur (Şekil 1C). Bağırsak epiteli ve epidermise benzer şekilde, kesici dişteki epitelyal yenilenme, öncelikle aktif olarak döngüsel kök hücreler ve bunların transit-amplifikasyon hücreleri 14,15,16,17 olarak adlandırılan, her ikisi de servikal döngünün iç kısmında bulunan yüksek oranda proliferatif ara torunları tarafından desteklenir. Bununla birlikte, kesici epitelin rejenerasyon sırasında hareketsiz kök hücreler içerip içermediği ve kullanıp kullanmadığı henüz belirlenmemiştir. Buna karşılık, apikal pulpada hem aktif hem de hareketsiz dental mezenkimal kök hücreler tanımlanmıştır ve hareketsiz kök hücreler, yaralanma onarımı sırasında aktive olan bir yedek popülasyon olarak işlev görür13,18.
Fare kesici dişlerin yenilenmesi ve yenilenmesinin biyolojisi üzerine yapılan keşiflerin çoğu, örneklerin farklı zamansal kavşaklarda elde edildiği, sabitlendiği, işlendiği ve daha sonra belirli bir düzlem boyunca mikron inceliğinde dilimler halinde bölümlere ayrıldığı histolojik araştırmalardan kaynaklanmıştır. Bilim adamları, soy takibini veya genetik bozulmaları mümkün kılan farklı fare modellerinden alınan histolojik kesitlerin ayrıntılı analizi yoluyla, farklı progenitör popülasyonların hücre soylarının yanı sıra kesici diş homeostazını ve yaralanma onarımını kontrol eden genetik ve sinyal yollarını tanımladılar 19,20,21. Bununla birlikte, bölümlerdeki hayati olmayan hücrelerin statik iki boyutlu (2B) görüntüleri, hücre şekli değişiklikleri, hareketleri ve hücresel kinetik gibi canlı dokudaki hücresel davranışların ve uzamsal organizasyonların tam spektrumunu yakalayamaz. Doku kesiti ile çözülemeyen bir zaman ölçeğinde meydana gelen bu hızlı hücresel değişiklikleri tespit etmek ve ölçmek farklı bir strateji gerektirir. Ayrıca, bu tür bilgileri edinmek, diş hücrelerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini, farklı sinyal uyaranlarına nasıl tepki verdiğini ve doku yapılarını ve işlevlerini korumak için kendi kendini nasıl organize ettiğini anlamak için de kritik öneme sahiptir.
Üç uzamsal boyutu zamansal çözünürlükle bütünleştiren bir teknoloji olan iki foton mikroskobu22 kullanılarak dört boyutlu (4D) derin doku görüntülemenin ortaya çıkışı, kültürlenmiş doku eksplantlarının, organoidlerin ve hatta dokuların yerinde uzay-zamansal incelemesini sağlayarak histolojik analizin doğal sınırlamalarının üstesinden gelir 23,24,25,26 . Örneğin, gelişmekte olan diş epitelinin 4 boyutlu canlı görüntülemesi, doku büyümesini, sinyal merkezi oluşumunu ve diş epitel morfogenezini koordine eden hücre bölünmelerinin ve göçlerinin uzay-zamansal modellerini ortaya çıkarmıştır 27,28,29,30,31,32. Yetişkin fare kesici dişinde, 4D görüntüleme son zamanlarda diş epitel yaralanması onarımı sırasında hücresel davranışları incelemek için uyarlanmıştır. Canlı görüntüleme, suprabazal tabakadaki stratum intermedium hücrelerinin, hasarlı epiteli yeniden oluşturmak için bazal tabakada doğrudan ameloblastlara dönüştürülebileceğini ortaya koydu ve geleneksel epitel hasarı onarımı paradigmasınameydan okudu 15.
Burada, labial servikal döngüdeki epitel hücrelerine odaklanarak yetişkin fare kesici dişinin diseksiyonunu, kültürlenmesini ve görüntülenmesini açıklıyoruz (Şekil 1). Bu teknik, diş hücresi canlılığını 12 saatten fazla korur ve floresan etiketli hücrelerin tek hücre çözünürlüğünde canlı olarak izlenmesine izin verir. Bu yaklaşım, hücre hareketi ve göçünün yanı sıra normal kültür koşulları altında veya genetik, fiziksel ve kimyasal bozulmalara yanıt olarak hücre şekli ve bölünme oryantasyonundaki dinamik değişikliklerin araştırılmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı doku görüntüleme, hücrelerin niş ortamlarında tutulduklarında dinamik süreçlerini ve davranışlarını incelememizi sağlayan önemli bir tekniktir41. İdeal olarak, canlı görüntüleme yüksek uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, memeli organları için in vivo görüntüleme, doku erişilemezliği, optik opaklık ve hayvanı veya organı uzun süre hareketsiz hale getirme zorluğu nedeniyle zor olabilir<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UCLA Gelişmiş Işık Mikroskobu/Spektroskopi Laboratuvarı’na ve California NanoSystems Enstitüsü’ndeki (RRID:SCR_022789) Leica Microsystems Mükemmeliyet Merkezi’ne iki foton mikroskobu sağladıkları için teşekkür ederiz. AS, İsrail Bilim Vakfı’ndan ISF 604-21 tarafından desteklenmiştir. JH, NIH/NIDCR’den R03DE030205 ve R01DE030471 tarafından desteklendi. AS ve JH, Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı’ndan (BSF) hibe 2021007 de desteklendi.
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
References
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
- Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
- Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
- Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Hu, J. K. -. H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
- Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
- Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
- Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
- Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
- Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
- Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
- Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
- Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
- Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
- Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
- Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
- Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis – their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
- Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- McCoy, R. J., O’Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
- Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
- Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).
