単層グラフェンのクライオ電子顕微鏡グリッドへの高分解能構造決定への応用
Summary
極低温電子顕微鏡(クライオEM)グリッドに支持層を適用することで、粒子密度を高め、空気と水の界面との相互作用を制限し、ビーム誘起運動を低減し、粒子配向の分布を改善することができます。この論文では、クライオサンプル調製を改善するために、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェンの単層でコーティングするための堅牢なプロトコルについて説明します。
Abstract
極低温電子顕微鏡(クライオEM)では、精製された高分子を穴あき炭素箔を含有するグリッドに塗布します。次に、分子を吸い取って余分な液体を除去し、約20〜100 nmの厚さのガラス質氷の層で急速に凍結し、幅約1 μmの箔穴に懸濁させます。得られた試料は、極低温透過型電子顕微鏡を用いて画像化され、適切なソフトウェアを用いて画像処理を行った後、原子分解能に近い構造を決定することができる。クライオ電子顕微鏡は広く採用されていますが、サンプル調製は依然としてクライオ電子顕微鏡ワークフローにおける深刻なボトルネックであり、ユーザーは懸濁したガラス質の氷の中でサンプルの挙動が悪いという課題に遭遇することがよくあります。最近では、グラフェンの単一の連続した層でクライオ電子顕微鏡グリッドを修飾する方法が開発されており、グラフェンは支持面として機能し、多くの場合、画像領域内の粒子密度を高め、粒子と空気-水界面の間の相互作用を減らすことができます。ここでは、グラフェンをクライオ電子顕微鏡グリッドに適用し、得られたグリッドの相対的な親水性を迅速に評価するための詳細なプロトコルを提供します。さらに、グラフェンの特徴的な回折パターンを可視化することでグラフェンの存在を確認するEM法についても述べる。最後に、比較的低濃度の純粋なサンプルを用いて、Cas9複合体の2.7 Åの分解能密度マップを迅速に再構築することにより、これらのグラフェン担体の有用性を実証します。
Introduction
単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子を可視化するために広く使用されている方法に進化しました1。直接電子検出 2,3,4、データ取得5、画像処理アルゴリズム 6,7,8,9,10 の進歩により、クライオ電子顕微鏡は、急速に増加する高分子の原子分解能に近い分解能の 3D 構造を生成できるようになりました 11.さらに、このアプローチの単一分子の性質を活用することにより、ユーザーは単一のサンプルから複数の構造を決定することができ12、13、14、15、生成されたデータを使用して不均一な構造アンサンブルを理解することの有望性を強調しています16、17。このような進歩にもかかわらず、クライオ試料グリッド調製のボトルネックは続いています。
クライオ電子顕微鏡による構造特性評価では、生体試料を水溶液に十分に分散させた後、ガラス固化と呼ばれるプロセスで瞬間凍結する必要があります18,19。目標は、通常はアモルファス炭素の層に切り込まれた等間隔の穴に懸濁したガラス化氷の均一な薄層に粒子を捕捉することです。このパターン化されたアモルファスカーボン箔は、銅または金の支持棒のメッシュを支持するTEMグリッドによって支持されています。標準的なワークフローでは、グリッドは、サンプルを塗布する前にグロー放電プラズマ処理を使用して親水性になります。余分な液体は濾紙で吸い取られ、タンパク質溶液が穴を横切って薄い液体膜を形成し、プランジ凍結中に容易にガラス化できます。一般的な課題には、空気水界面(AWI)への粒子の局在化とそれに続く変性20,21,22または好ましい配向の採用23,24,25、粒子の穴内への移動ではなく炭素箔への付着、および穴内の粒子のクラスタリングと凝集26が含まれます.不均一な氷の厚さも懸念事項です。厚い氷は、電子散乱の増加により顕微鏡写真のバックグラウンドノイズのレベルが高くなる可能性がありますが、極端に薄い氷はより大きな粒子を排除する可能性があります27。
これらの課題に対処するために、さまざまな薄いサポートフィルムを使用してグリッド表面をコーティングし、粒子をこれらのサポートに乗せ、理想的には空気と水の界面との相互作用を回避できるようにしています。グラフェン支持体は、部分的には、その高い機械的強度と、支持体層28によって付加されるバックグラウンド信号を低減する最小の散乱断面積と相まって、大きな有望性を示している。グラフェンは、バックグラウンドノイズへの寄与が最小限であることに加えて、顕著な電気伝導率と熱伝導率も示します29。グラフェンおよび酸化グラフェンでコーティングされたグリッドは、より高い粒子密度、より均一な粒子分布30、およびAWI22への局在の減少をもたらすことが示されている。さらに、グラフェンは、さらに次のように修飾することができる支持表面を提供する:1)官能基化31,32,33を通じてグリッド表面の物理化学的特性を調整する。または2)目的のタンパク質の親和性精製を促進する結合剤34,35,36。
本稿では、クライオ電子顕微鏡グリッドをグラフェン30の単一の均一な層でコーティングするための既存の手順を変更しました。この変更は、歩留まりと再現性の向上を目的として、プロトコル全体でグリッド処理を最小限に抑えることを目的としています。さらに、プランジング前にグリッドを親水性にする際のさまざまなUV/オゾン処理の有効性を評価するためのアプローチについても説明します。グラフェンでコーティングされたグリッドを用いたクライオ電子顕微鏡サンプル調製のこのステップは重要であり、得られたグリッドの相対的な親水性を定量化する簡単な方法が有用であることがわかりました。このプロトコルを用いて、ガイドRNAおよび標的DNAとの複合体において、触媒的に不活性な 化膿菌 Cas9の高解像度3D再構成を生成することにより、構造決定にグラフェンコーティングされたグリッドを採用することの有用性を実証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
クライオ電子顕微鏡によるサンプル調製には多くの技術的課題が伴い、ほとんどのワークフローでは、脆弱なグリッドを損傷しないように細心の注意を払って手動で操作する必要があります。さらに、ガラス化に対するサンプルの適応性は予測不可能です。粒子は、空気と水の界面やグリッドを覆う固体支持箔と相互作用することが多く、非常に高いタンパク質濃度を適用しない限り、粒子?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
標本は、MIT.nanoのクライオ電子顕微鏡施設で、Arnold and Mabel Beckman Foundationのおかげで得られた顕微鏡で準備され、画像化されました。接触角イメージングデバイスは、MIT Metropolis Maker Spaceでプリントされました。Nieng Yan氏とYimo Han氏の研究室、そしてMIT.nanoのスタッフには、この手法の採用を通じてサポートしてくださったことに感謝します。特に、Guanhui Gao博士とSarah Sterling博士の洞察に満ちた議論とフィードバックに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01-GM144542、5T32-GM007287、およびNSF-CAREER助成金2046778の支援を受けました。デイビス研究室での研究は、アルフレッド・P・スローン財団、ジェームズ・H・フェリー基金、MIT J-Clinic、ホワイトヘッド・ファミリーの支援を受けています。
Materials
| 250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
| 50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
| Acetone | Fisher | A949-4 | |
| Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
| Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
| Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
| CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
| easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
| Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
| Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
| Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
| Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
| Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
| Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
| Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
| Isopropanol | Sigma | W292907 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
| Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
| Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
| P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
| P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
| Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
| Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
| Straightedge | ULINE | H-6560 | |
| Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
| UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
| Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
| Whatman paper | VWR | 28297-216 |
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