Anvendelsen av støttelag til kryogen elektronmikroskopi (kryoEM) nett kan øke partikkeltettheten, begrense interaksjoner med luft-vanngrensesnittet, redusere stråleindusert bevegelse og forbedre fordelingen av partikkelorienteringer. Dette papiret beskriver en robust protokoll for å belegge cryoEM-rutenett med et monolag grafen for forbedret klargjøring av kryoprøver.
I kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) påføres rensede makromolekyler på et rutenett som bærer en holey karbonfolie; Molekylene blir deretter blottet for å fjerne overflødig væske og raskt frosset i et omtrent 20-100 nm tykt lag av glassaktig is, suspendert over omtrent 1 μm brede foliehull. Den resulterende prøven avbildes ved hjelp av kryogen transmisjonselektronmikroskopi, og etter bildebehandling ved hjelp av egnet programvare kan næratomoppløsningsstrukturer bestemmes. Til tross for at cryoEM er utbredt, er prøvepreparering fortsatt en alvorlig flaskehals i cryoEM-arbeidsflyter, med brukere som ofte møter utfordringer knyttet til prøver som oppfører seg dårlig i den suspenderte glassmassen. Nylig har metoder blitt utviklet for å modifisere kryoEM-gitter med et enkelt kontinuerlig lag av grafen, som fungerer som en støtteflate som ofte øker partikkeltettheten i det avbildede området og kan redusere interaksjoner mellom partikler og luft-vanngrensesnittet. Her gir vi detaljerte protokoller for anvendelse av grafen til kryoEM-nett og for raskt å vurdere den relative hydrofiliteten til de resulterende nettene. I tillegg beskriver vi en EM-basert metode for å bekrefte tilstedeværelsen av grafen ved å visualisere dens karakteristiske diffraksjonsmønster. Til slutt demonstrerer vi nytten av disse grafenstøttene ved raskt å rekonstruere et 2.7 Å-oppløsningstetthetskart over et Cas9-kompleks ved hjelp av en ren prøve i en relativt lav konsentrasjon.
Enkeltpartikkelkryogen elektronmikroskopi (cryoEM) har utviklet seg til en mye brukt metode for visualisering av biologiske makromolekyler1. Drevet av fremskritt innen direkte elektrondeteksjon 2,3,4, datainnsamling5 og bildebehandlingsalgoritmer 6,7,8,9,10, er cryoEM nå i stand til å produsere 3D-strukturer med nær atomoppløsning av et raskt voksende antall makromolekyler11. Videre, ved å utnytte tilnærmingens enkeltmolekylære natur, kan brukerne bestemme flere strukturer fra en enkelt prøve 12,13,14,15, og fremheve løftet om å bruke dataene som genereres for å forstå heterogene strukturelle ensembler 16,17. Til tross for denne fremgangen fortsetter flaskehalser i klargjøring av kryoprøver.
For strukturell karakterisering ved kryoEM, bør biologiske prøver være godt dispergert i vandig løsning og må deretter flashfryses gjennom en prosess som kalles vitrifisering 18,19. Målet er å fange partikler i et jevnt tynt lag av forglasset is suspendert over regelmessig fordelte hull som vanligvis kuttes i et lag av amorft karbon. Denne mønstrede amorfe karbonfolien støttes av et TEM-gitter som bærer et nett av kobber- eller gullstøttestenger. I standard arbeidsflyter gjengis rister hydrofile ved hjelp av en plasmabehandling med glødeutladning før prøven påføres. Overflødig væske blottes med filterpapir, slik at proteinløsningen danner en tynn væskefilm over hullene som lett kan vitrifiseres under frysing av lunger. Vanlige utfordringer inkluderer partikkellokalisering til luft-vanngrensesnittet (AWI) og påfølgende denaturering20,21,22 eller adopsjon av foretrukne orienteringer 23,24,25, partikkeladherens til karbonfolien i stedet for å migrere inn i hullene, og klynging og aggregering av partiklene i hullene26. Ujevn istykkelse er en annen bekymring; Tykk is kan gi høyere bakgrunnsstøy i mikrografene på grunn av økt elektronspredning, mens ekstremt tynn is kan utelukke større partikler27.
For å møte disse utfordringene har en rekke tynne støttefilmer blitt brukt til å belegge gitteroverflater, slik at partikler kan hvile på disse støttene og, ideelt sett, unngå interaksjoner med luft-vanngrensesnittet. Grafenstøtter har vist stort løfte, delvis på grunn av deres høye mekaniske styrke kombinert med deres minimale spredningstverrsnitt, noe som reduserer bakgrunnssignalet lagt til av støttelaget28. I tillegg til det minimale bidraget til bakgrunnsstøy, viser grafen også bemerkelsesverdig elektrisk og termisk ledningsevne29. Grafen og grafenoksydbelagte nett har vist seg å gi høyere partikkeltetthet, mer jevn partikkelfordeling30 og redusert lokalisering til AWI22. I tillegg gir grafen en støtteflate som kan modifiseres ytterligere til: 1) justere de fysiokjemiske egenskapene til gitteroverflaten gjennom funksjonalisering 31,32,33; eller 2) parkoblingsmidler som letter affinitetsrensing av proteiner av interesse 34,35,36.
I denne artikkelen har vi endret en eksisterende prosedyre for å belegge cryoEM-gitter med et enkelt jevnt lag grafen30. Modifikasjonene tar sikte på å minimere netthåndtering gjennom hele protokollen, med mål om å øke utbyttet og reproduserbarheten. I tillegg diskuterer vi vår tilnærming for å evaluere effekten av ulike UV/ozon-behandlinger ved å gjøre ristene hydrofile før de stuper. Dette trinnet i klargjøring av kryoEM-prøver ved bruk av grafenbelagte rutenett er kritisk, og vi har funnet ut at vår enkle metode for å kvantifisere den relative hydrofiliteten til de resulterende rutene er nyttig. Ved hjelp av denne protokollen demonstrerer vi nytten av å bruke grafenbelagte nett for strukturbestemmelse ved å generere en høyoppløselig 3D-rekonstruksjon av katalytisk inaktive S. pyogenes Cas9 i kompleks med guide RNA og mål-DNA.
CryoEM-prøvepreparering innebærer en rekke tekniske utfordringer, med de fleste arbeidsflyter som krever at forskere manuelt manipulerer skjøre rister med ekstrem forsiktighet for å unngå å skade dem. I tillegg er tilgjengeligheten til enhver prøve til vitrifisering uforutsigbar; Partikler interagerer ofte med luft-vann-grensesnittet eller med den faste støttefolien som ligger over ristene, noe som kan føre til at partikler vedtar foretrukne retninger eller ikke kommer inn i bildehullene med mindre svært høye …
The authors have nothing to disclose.
Prøver ble utarbeidet og avbildet på CryoEM-anlegget i MIT.nano på mikroskoper anskaffet takket være Arnold og Mabel Beckman Foundation. Kontaktvinkelbildeenheter ble skrevet ut på MIT Metropolis Maker Space. Vi takker laboratoriene til Nieng Yan og Yimo Han, og ansatte ved MIT.nano for deres støtte gjennom vedtakelsen av denne metoden. Spesielt takker vi Dr. Guanhui Gao og Sarah Sterling for deres innsiktsfulle diskusjoner og tilbakemeldinger. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendene R01-GM144542, 5T32-GM007287 og NSF-CAREER grant 2046778. Forskning i Davis-laboratoriet støttes av Alfred P. Sloan Foundation, James H. Ferry Fund, MIT J-Clinic og Whitehead Family.
250 mL beaker (3x) | Fisher | 02-555-25B | |
50 mL beaker (2x) | Corning | 1000-50 | |
Acetone | Fisher | A949-4 | |
Aluminum foil | Fisher | 15-078-292 | |
Ammonium persulfate | Fisher | (I17874 | |
Coverslips 50 mm x 24 mm | Mattek | PCS-1.5-5024 | |
CVD graphene | Graphene Supermarket | CVD-Cu-2×2 | |
easiGlow discharger | Ted-Pella | 91000S | |
Ethanol | Millipore-Sigma | 1.11727 | |
Flat-tip tweezers | Fisher | 50-239-60 | |
Glass cutter | Grainger | 21UE26 | |
Glass petri plate and cover | VWR | 75845-544 | |
Glass serological pipette | Fisher | 13-676-34D | |
Grid Storage Case | EMS | 71146-02 | |
Hot plate | Fisher | 07-770-108 | |
Isopropanol | Sigma | W292907 | |
Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
Lab scissors | Fisher | 13-806-2 | |
Methyl-Methacrylate EL-6 | Kayaku | MMA M310006 0500L1GL | |
Molecular grade water | Corning | 46-000-CM | |
Negative action tweezers (2x) | Fisher | 50-242-78 | |
P20 pipette | Rainin | 17014392 | |
P200 pipette | Rainin | 17008652 | |
Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
Pipette tips | Rainin | 30389291 | |
Quantifoil grids with holey carbon | EMS | Q2100CR1 | |
Spin coater | SetCas | KW-4A | with chuck SCA-19-23 |
Straightedge | ULINE | H-6560 | |
Thermometer | Grainger | 3LRD1 | |
UV/Ozone cleaner | BioForce | SKU: PC440 | |
Vacuum desiccator | Thomas Scientific | 1159X11 | |
Whatman paper | VWR | 28297-216 |