הפקת ארס מהצרעה הטפילית Trichogramma dendrolimi באמצעות פונדקאי מלאכותי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת ארס מ Trichogramma dendrolimi באמצעות מארח מלאכותי שנוצר עם סרט פוליאתילן ותמיסת חומצות אמינו.
Abstract
צרעות טפיליות הן קבוצה מגוונת של חרקים הימנופטריים המשמשים כמשאבים יקרי ערך להדברה ביולוגית של מזיקים. כדי להבטיח טפילות מוצלחת, צרעות טפיליות מזריקות ארס לפונדקאים שלהן כדי לדכא את חסינות המארחים שלהן, לווסת את התפתחות הפונדקאים, חילוף החומרים ואפילו ההתנהגות שלהם. עם יותר מ-600,000 מינים מוערך, מגוון הצרעות הטפיליות עולה על זה של בעלי חיים ארסיים אחרים, כגון נחשים, חלזונות חרוט ועכבישים. ארס צרעה טפילי הוא מקור לא נחקר מספיק של מולקולות ביו-אקטיביות עם יישומים פוטנציאליים בהדברה וברפואה. עם זאת, איסוף ארס הטפילים מאתגר בשל חוסר היכולת להשתמש בגירוי ישיר או חשמלי והקושי בדיסקציה בגלל גודלם הקטן. טריכוגרמה (שם מדעי: Trichogramma ) הוא סוג של צרעות טפיליות ביצים זעירות (~0.5 מ”מ) הנמצאות בשימוש נרחב להדברה ביולוגית של מזיקים לפידופטרניים הן בחקלאות והן ביערות. כאן, אנו מדווחים על שיטה להפקת ארס מ T. dendrolimi באמצעות פונדקאים מלאכותיים. פונדקאים מלאכותיים אלה נוצרים עם סרט פוליאתילן ותמיסות חומצות אמינו ולאחר מכן מחוסנים בצרעות טריכוגרמה לטיפול בטפילות. לאחר מכן נאסף הארס ורוכז. שיטה זו מאפשרת מיצוי כמויות גדולות של ארס טריכוגרמה תוך הימנעות מזיהום מרקמות אחרות הנגרמות כתוצאה מדיסקציה, בעיה נפוצה בפרוטוקולי דיסקציה של מאגרי ארס. גישה חדשנית זו מאפשרת את המחקר של ארס טריכוגרמה , וסוללת את הדרך למחקר חדש וליישומים פוטנציאליים.
Introduction
צרעות טפיליות הן חרקים טפיליים המהווים משאבים חשובים להדברה ביולוגית1. יש מגוון רחב של צרעות טפיליות, עם מעל 600,000 מינים מוערכים2. מגוון הצרעות הטפיליות עולה בהרבה על זה של פרוקי רגליים ארסיים אחרים, כגון נחשים, חלזונות חרוט, עכבישים, עקרבים ודבורים. ארס הוא גורם טפילי חשוב בצרעות טפיליות. לטפילות מוצלחת, הארס מוזרק לפונדקאי, ומווסת את התנהגותו, חסינותו, התפתחותו וחילוף החומרים של הפונדקאי3. יתר על כן, הארס של צרעות טפיליות מציג מגוון יוצא דופן במבנים המולקולריים שלו, במטרות ובתפקודים, ומשקף קו-אבולוציה מורכבת עם המארחים שלהם. לפיכך, ארס טפילי הוא משאב יקר ערך ולא מוערך מספיק של מולקולות פעילות למטרות קוטלי חרקים או רפואיים4. בניגוד לארס של נחשים, חלזונות חרוט, עכבישים, עקרבים ודבורים, ארס צרעה טפילי אינו יכול להיאסף על ידי גירוי ישיר או גירוי חשמלי5. השיטה הנוכחית להפקת ארס צרעה טפילי היא לנתח את מאגר הארס. עם זאת, צרעות טפיליות הן לרוב קטנות, ונתיחת צרעות טפיליות דורשת מיומנויות טכניות גבוהות. לכן, אם נוכל למצוא דרך לאסוף את ארס הצרעות הטפיליות בצורה יעילה ונוחה, זה יעזור מאוד לחקור את הארס של צרעות טפיליות.
טריכוגרמה (שם מדעי: Trichogrammatidae) היא סוג של צרעות טפיליות זעירות (~0.5 מ”מ אורך)6. צרעות אלה הן בין חומרי ההדברה הביולוגית הנפוצים ביותר, במיוחד נגד ביצים של מזיקים לפידופטרנים שונים הן בחקלאות והן ביערות. לדוגמה, T. dendrolimi, אחד ממיני הטריכוגרמה הנפוצים ביותר בסין, יושם באופן נרחב להדברת מגוון מזיקים חקלאיים וייעוריים, כגון Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis, ו Chilo suppressalis. מחקרים קודמים הראו כי צרעות טריכוגרמה יכולות להזריק את ביציהן לפונדקאים מלאכותיים7. ניתן ליצור פונדקאים מלאכותיים באמצעות חומרים כגון שעווה8, אגר9, פרפילם10 ופילם פלסטיק11. התמיסה בפונדקאים מלאכותיים המשרה מספיק אוביפוזיציה עבור טריכוגרמה יכולה להיות פשוטה, כגון חומצות אמינו או מלחים אנאורגניים12. בהתבסס על המאפיין כי T. dendrolimi יכול לטפיל פונדקאים מלאכותיים, מחקר זה מספק שיטה חדשה להפקת ארס מצרעות טפיליות באמצעות פונדקאים מלאכותיים. גישה זו נועדה לטפל בחסרונות של תפוקה נמוכה, טוהר נמוך ורגישות לזיהום בטכניקות מיצוי נוכחיות. באמצעות שיטה זו, כמות גדולה של ארס טוהר גבוה מ T. dendrolimi ניתן לחלץ, אשר עונה על הצרכים של מחקר מדעי וסינון של מולקולות ביו-אקטיביות למטרות קוטלי חרקים או רפואיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה להפקת ארס מ T. dendrolimi באמצעות פונדקאים מלאכותיים. להלן נקודות המפתח בניסוי איסוף הארס. (1) במהלך ההכנה, T. dendrolimi חייב להיות מורדם במהירות עם ריכוז מתאים של CO2. אם ריכוז CO2 נמוך מדי, זה לא יהיה מספיק כדי להרדים את Trichogramma במהירות. לעומת זאת, אם הריכוז גב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה כספית מהקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן (מענק מס ‘323QN262), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘31701843 ו -32172483), קרן החדשנות המדעית והטכנולוגית של ג’יאנגסו לחקלאות (מענק מס ‘. CX(22)3012 ו- CX(21)3008), קרן “Shuangchuang Doctor” של מחוז ג’יאנגסו (מענק מס ‘202030472), וקרן הסטארט-אפים של האוניברסיטה החקלאית נאנג’ינג (מענק מס ‘804018).
Materials
| 10 μm Nylon Net | Millipore | NY1002500 | For filtering the eggs |
| 10% Polyvinyl alcohol | Aladdin | P139533 | For attractting T. dendrolimi to lay eggs |
| 10% Sucrose water | Sinopharm Chemical Reagent | 10021463 | Feed Trichogramma dendrolimi |
| 4x LDS loading buffer | Ace Hardware | B23010301 | SDS-PAGE |
| Collection box | Deli | 8555 | Container for T. dendrolimi parasitism |
| Future PAGE 4–12% (12 wells) | Ace Hardware | J70236502X | SDS-PAGE |
| GenScript eStain L1 protein staining apparatus | GenScript | L00753 | SDS-PAGE |
| Glass grinding rod | Applygen | tb6268 | Semicircular protrudations |
| L- Leucine | Solarbio | L0011 | Artificial host components |
| L-Histidine | Aladdin | A2219458 | Artificial host components |
| L-Phenylalanine | Solarbio | P0010 | Artificial host components |
| Mini-Centrifuges | Scilogex | D1008 | Centrifuge |
| MOPS-SDS running buffer | Ace Hardware | B23021 | SDS-PAGE |
| Omni-Easy Instant BCA protein assay kit | Shanghai Yamay Biomedical Technology | ZJ102 | For esimation of venom protein concentration |
| PCR plate layout of 96 holes | Thermo Fisher | AB1400L | Semicircular protrudations |
| Polyethylene plastic film | Suzhou Aopang Trading | 001c5427 | Artificial egg card |
| Prestained color protein marker(10–180 kDa) | YiFeiXue Biotech | YWB007 | SDS-PAGE |
| Rubber band | Guangzhou qianrui biology science and technology | 009 | Tighten the plastic film and the collection box |
| Silicone rubber septa mat, 96-well, round hole | Sangon Biotech | F504416-0001 | Semicircular protrudations |
References
- Pennacchio, F., Strand, M. R. Evolution of developmental strategies in parasitic hymenoptera. Annual Review of Entomology. 51, 233-258 (2006).
- Yan, Z. C., Ye, X. H., Wang, B. B., Fang, Q., Ye, G. Y. Research advances on composition, function and evolution of venom proteins in parasitoid wasps. Chinese Journal of Biological Control. 33 (1), 1-10 (2017).
- Asgari, S., Rivers, D. B. Venom proteins from endoparasitoid wasps and their role in host-parasite interactions. Annual Review of Entomology. 56, 313-335 (2011).
- Moreau, S. J. M., Guillot, S. Advances and prospects on biosynthesis, structures, and functions of venom proteins from parasitic wasps. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 35 (11), 1209-1223 (2005).
- Yan, Z. C., et al. A venom serpin splicing isoform of the endoparasitoid wasp Pteromalus puparum suppresses host prophenoloxidase cascade by forming complexes with host hemolymph proteinases. Journal Biological Chemistry. 292 (3), 1038-1051 (2017).
- Woelke, J. B., et al. Description and biology of two new egg parasitoid species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) reared from eggs of Heliconiini butterflies (Lepidoptera: Nymphalidae: Heliconiinae) in Panama. Journal of Natural History. 53 (11-12), 639-657 (2019).
- Zang, L. S., Wang, S., Zhang, F., Desneux, N. Biological control with Trichogramma in China: History, present status, and perspectives. Annual Review of Entomology. 66, 463-484 (2021).
- Nettles, W. C. J., Morrison, R. K., Xie, Z. N., Ball, D., Shenkir, C. A., Vinson, S. B. Synergistic action of potassium chloride and magnesium sulfate on parasitoid wasp oviposition. Science. 218, 4568 (1982).
- Tilden, R. L., Ferkovich, S. M. Kairomonal stimulation of oviposition into an artificial substrate by the endoparasitoid Microplitis croceipes (Hymenoptera)Braconidae). Annals of the Entomological Society of America. 81 (1), 152-156 (1988).
- Xie, Z. N., Li, L., Xie, Y. Q. In vitro culture of Habrobracon hebetor. Chinese Journal of Biological Control. 5 (2), 49-51 (1989).
- Han, S. T., Liu, W. H., Li, L. Y., Chen, Q. X., Zeng, B. K. Breeding Trichogramma ostriniae with artificial eggs. Journal of Environmental Entomology. 21 (1), 9-12 (1999).
- Li, L. Y., Chen, Q. X., Liu, W. H. Oviposition behavior of twelve species of Trichogramma and its influence on the efficiency of rearing them in vitro. Journal of Environmental Entomology. 11 (1), 31-35 (1989).
- Xing, J. Q., Li, L. Y. Rearing of an egg parasite Anastatus japonicus Ashmead in vitro. Acta Entomologica Sinica. 33 (2), 166-173 (1990).
- Moreau, S. J. M. "It stings a bit but it cleans well": Venoms of Hymenoptera and their antimicrobial potential. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 186-204 (2013).
- Moreau, S. J. M., Asgari, S. Venom proteins from parasitoid wasps and their biological function. Toxins. 7 (7), 2385-2412 (2015).
