我们提供了一种通过输注脂多糖建立猪实验性内毒素血症休克模型的实验方案。
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摘要
摘要
脓毒症和脓毒性休克在重症监护病房（ICU）接受治疗的患者中十分常见，是这些患者死亡的主要原因之一。其病因是机体对感染产生的免疫反应失调。即使采用优化治疗，病死率仍然很高，因此有必要进一步深入了解其病理生理机制并开发新的治疗方案。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，而这类细菌常导致引发脓毒症和脓毒性休克的感染。
脓毒症和脓毒性休克的严重性及高死亡率使得在人体中开展标准化实验研究成为不可能。因此，需要借助动物模型进行深入研究。猪在解剖结构、生理特征和体型方面与人类高度相似，特别适合用于此目的。
本方案通过输注脂多糖（LPS）建立猪内毒素血症休克的实验模型。我们能够可靠地诱导出脓毒性休克患者中常见的多种变化，包括血流动力学不稳定、呼吸衰竭和酸中毒。这将使研究人员能够深入理解这一高度相关的临床状况，并在实验环境中评估新的治疗策略。
引言
脓毒症和脓毒性休克是接受重症监护治疗患者死亡的主要原因之一1,2,3。当感染引发免疫反应失调并导致多器官功能衰竭时，即发生脓毒症。其特征为危及生命的症状，包括血流动力学不稳定、呼吸窘迫、肝肾功能衰竭以及认知障碍4,5。脓毒性休克是脓毒症的一个亚型，症状尤为严重，显著增加死亡风险。这些症状包括持续性低血压，需使用血管加压药物治疗，以及血清乳酸水平超过 2 mmol∙L-1 4,5。即使接受住院治疗，脓毒性休克患者的死亡率估计仍高达 40%1,3,5。
革兰氏阴性菌（如Pseudomonas和Escherichia coli）常引起感染，从而触发这种失调的免疫反应4。其潜在的病理生理机制复杂，尚未完全阐明。其中一个已有明确描述的方面是病原体相关分子模式（PAMPs）激活免疫细胞上的Toll样受体，导致肿瘤坏死因子-α（TNFα）或白细胞介素1（IL 1）等细胞因子的释放4。其中一种PAMP是脂多糖（LPS），它是革兰氏阴性菌细胞膜的组成成分6。LPS已在动物模型中被用于诱导内毒素血症及内毒素性休克7,8。
动物模型为开发和研究新的治疗策略提供了可控且标准化的环境。由于猪模型具有与人类相似的解剖结构、免疫生理特性以及相近的血流动力学参数，因此特别适用于研究内毒素性休克的影响9,10。此外，由于猪的气道和血管尺寸与人类相近，临床上常用于人类患者的标准化医疗设备可直接应用于猪，从而便于实施各种介入操作和血流动力学监测。
通过本方案，我们提供了一种通过静脉输注来源于大肠杆菌（E. coli）的脂多糖（LPS）在猪体内建立内毒素血症休克的实验模型。为监测其效应，我们测量了血流动力学和肺功能参数，包括动脉血压、心率、外周血氧饱和度、肺动脉压和气道压力。为评估内毒素血症对脑部氧供的影响，我们采用了近红外光谱技术（NIRS）。该方法可通过贴于前额的粘附电极无创评估脑组织氧饱和度11。
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方案
本方案中的实验已获得德国莱茵兰-普法尔茨州国家及机构动物护理委员会（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz，科布伦茨，德国，TVA G21-1-080）的批准。实验实施遵循ARRIVE指南。本研究使用了六只健康的雄性德国兰德雷斯猪，年龄为2-3个月，体重为30-35 kg。实验时间线详见图1。本方案中使用的所有材料和仪器的详细信息列于材料表中。
图1：实验时间线。 在动物准备完成并经过30分钟稳定期后，采集基线健康指标。通过30分钟内的LPS注射诱导内毒素血症，并在另30分钟后采集0小时测量值；此后每小时持续测量，共4小时。缩写：BLH = 基线健康状态；LPS = 脂多糖。请点击此处查看该图的放大版本。
1. 动物准备
- 尽可能让动物留在其常规环境中，以尽量减少应激。在实施麻醉前 6 小时停止喂食，但可自由饮水。
- 仍在动物正常环境中时，通过肌肉注射给予阿扎哌隆（3 mg∙kg-1）和咪达唑仑（0.5 mg kg-1）进行镇静。
- 待镇静起效后（通常在给药后约 15–20 分钟内发生），将猪转移至实验室。
注意：在转移过程中必须确保持续镇静；根据所在地区的法律法规，此过程可能需要兽医全程监护。 - 在运输过程中需密切注意维持猪的正常体温（约 38 °C）。例如，可考虑用毯子覆盖动物以防止低体温。
注意：运输时间应控制在镇静持续时间范围内，通常不超过 30 至 60 分钟。 - 消毒后，通过在耳缘静脉插入 22 G 导管建立静脉通路。在移动猪只或开始麻醉诱导之前，务必确保导管固定牢固，以防因突然动作导致移位。
- 使用夹在尾巴或耳朵上的传感器持续监测外周血氧饱和度。
2. 麻醉与机械通气
- 静脉注射芬太尼（fentanyl）4 µg kg-1）和丙泊酚（3 mg/kg-1以诱导麻醉。
- 将猪置于仰卧位。
- 给予阿曲库铵（0.5 mg/kg）-1）作为肌肉松弛剂，并立即使用犬用通气面罩进行无创通气。将面罩覆盖在动物鼻口部，用拇指施加稳固压力，同时用中指/无名指向前牵拉下颌。将呼吸机参数设置如下： 吸入氧分数（FiO2 ) = 100%，潮气量 = 6–8 mL/kg-1，呼气末正压（PEEP）= 5 mbar，吸气峰压 ≤ 20 mbar，呼吸频率 = 18–20 次/分钟-1.
- 通过持续输注平衡电解质溶液（5 mL kg-1 h-1）、芬太尼（fentanyl）10 µg kg-1 h-1）和丙泊酚（6 mg/kg-1 h-1).
- 使用标准气管插管导管（内径6-7 mm）、导丝和配备Macintosh喉镜片（4号）的喉镜进行气管插管。
- 让助手打开口腔并将舌头向左侧固定。
- 插入Macintosh喉镜片，直至可见会厌。然后向上抬起喉镜，使会厌前移，从而暴露声带。有时会厌可能黏附于软腭，此时可用气管导管或探条轻轻侧向滑动，以松解会厌。
- 小心地将气管插管经声门插入，并取出管芯。若遇阻力，可尝试旋转导管，但避免施加过大压力。必要时，可使用较细的导管。导管到位后，向套囊注入10 mL空气。
- 将气管插管连接至呼吸机并开始通气。通过检测呼气末二氧化碳来确认导管位置正确。2 并进行双侧听诊。使用以下通气参数设置： FiO2 = 40%，潮气量 = 6–8 mL/kg-1，PEEP = 5 mbar，吸气与呼气时间比 = 1:2，呼吸频率 = 根据呼气末二氧化碳水平进行调整2 水平 <45 mmHg，通常为30-40分钟-1 .
注意：如果导管误插入食管，气体将充入胃部，导致可见的隆起。此时应立即拔出导管，给予1-2分钟无创通气，并重新正确放置导管。 - 插入胃管以防止反流或呕吐。若插入困难，可使用喉镜以更清楚地观察食管入口。
3. 仪器设备
- 分别在股动脉和股静脉中放置动脉导管和中心静脉导管，用于血流动力学监测和静脉容量治疗。
- 使用绷带牵拉并固定后肢，以更好地暴露股血管。
- 在置管前准备好所有必需材料。用生理盐水充满所有导管，并确保导丝和导管易于取用，以尽量减少多次穿刺尝试和不必要的失血。
- 在腹股沟区域使用酒精消毒剂消毒，并用无菌棉签擦拭。重复此过程两次。再次涂抹消毒剂但不擦拭，等待3分钟。在腹股沟区域覆盖无菌洞巾。
- 使用超声识别股血管。采用平面内超声引导的Seldinger技术进行置管，以最小化组织损伤和失血。
- 纵向显示股动脉。用连接针头的注射器穿刺动脉并持续抽吸。鲜红色、搏动性血液流出可确认为动脉穿刺。移除注射器，插入准备好的导丝。拔出针头，保留导丝在原位。
- 对股静脉采用相同操作步骤。暗红色、缓慢流动的血液可确认为静脉穿刺。
- 通过超声观察双侧股血管，确认两根导丝位置正确。
- 采用Seldinger技术，先插入动脉导引鞘，随后插入静脉导引鞘。通过从两条导管中抽取血液样本进行血气分析，确认导管位置正确。
- 确保所有导管均可顺利抽吸出血液。用生理盐水冲洗所有导管，防止血栓形成。
- 使用外科缝线将导管牢固固定于皮肤，防止移位。
- 将动脉导管和中心静脉导管连接至传感器，用于测量血流动力学参数。
- 将脉搏轮廓心输出量（PiCCO）导管插入动脉导引鞘，并将其连接至PiCCO监护仪的动脉压传感器和温度接口电缆。
- 将Swan-Ganz导管连接至传感器。
- 在持续测压的同时，将导管插入中心静脉导引鞘。当插入约30 cm且出现中心静脉压曲线时，充盈球囊。
- 在监测压力曲线的同时缓慢推进导管。当导管进入右心室时，压力曲线表现为高收缩压和低舒张压。继续推进导管将出现稳定的收缩压和升高的舒张压，提示导管已进入肺动脉。
- 将导管固定在此位置（通常为50至70 cm之间）。将PiCCO系统的注射液温度传感器连接至Swan-Ganz导管的近端腔。
- 剃除猪的前额毛发，并贴附粘性传感器电极以测量脑区氧饱和度（Cerebral Regional Oxygen Saturation）。
- 在麻醉诱导和置管完成后，让动物稳定30分钟，或直至血流动力学参数稳定，然后进行基线测量并诱导内毒素血症休克。
4. 诱导休克
注意：操作 LPS 时，务必佩戴手套、防护眼镜、口罩和实验服。避免与 LPS 直接接触。
- 通过将 5 mg LPS 溶解于 50 mL 0.9% NaCl 中，配制浓度为 100 µg mL-1 的 LPS 溶液。
- 在开始输注 LPS 前立即获取基础血流动力学参数。
- 在 30 分钟内给予 150 µg kg-1 剂量的 LPS（相当于以 300 µg kg-1∙h-1 的持续输注速率输注 30 分钟）。
- 30 分钟后，将输注速率降低至 15 µg∙kg-1∙h-1，并维持该速率至实验结束。
- 持续监测血流动力学参数，包括动脉压、肺动脉压、心率和通气参数；同时持续监测体温，以维持正常体温。
5. 血流动力学不稳定的治疗
- 当平均动脉血压低于 60 mmHg 时，使用 PiCCO 测量心指数（CI）、全心舒张末期容积指数（GEDI）和血管外肺水指数（ELWI）。根据 图 2 流程图中的建议处理低血压。
- 在 PiCCO 监护仪上按下 热稀释按钮（TD）。
- 按下 中心静脉压（CVP）输入 按钮，并输入当前的 CVP 值。
- 按下 开始 按钮。
- 当系统提示时，将 10 mL 的 冷生理盐水溶液 注入连接至 Swan-Ganz 导管的注射液温度传感器中。
注意：在 PiCCO 测量前或测量过程中不得注入其他任何液体，否则会影响测量结果。
- 获得 CI、GEDI 和 ELWI 的测量值后，根据 图 2 流程图处理血流动力学不稳定。如建议进行容量负荷治疗，则快速输注 200 mL 的 平衡电解质溶液；如建议使用儿茶酚胺类药物治疗，则将 去甲肾上腺素输注速率 增加 1 µg kg-1 h-1。
- 每当 平均动脉血压 降至 60 mmHg 以下 时，重复此过程。若出现严重血流动力学不稳定，应选择快速升级治疗方案。
图2：PiCCO指导下的血流动力学不稳定治疗。 在获取CI、GEDI和ELWI的测量值后，根据此图表进行治疗。本图改编自PiCCO用户指南12。缩写：PiCCO = 脉搏轮廓法心输出量；V+ = 容量负荷；cat = 儿茶酚胺治疗；V- = 容量减少；CI = 心脏指数；GEDI = 全舒张末期容积指数；ELWI = 血管外肺水指数。 请点击此处查看此图的放大版本。
6. 实验结束与安乐死
- 静脉注射 0.5 mg 芬太尼，等待 5 分钟，然后注射 200 mg 丙泊酚。
- 通过中心静脉导管快速注射 40 mL 1 M 氯化钾，处死猪。
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结果
本研究中，六只健康的雄性猪（年龄2-3个月，体重30-35 kg）在麻醉后接受脂多糖（LPS）输注，以诱导内毒素血症。为确定能够稳定诱发休克症状所需的合适LPS剂量，对猪给予了不同诱导剂量的LPS，范围从 100 µg kg-1 到 200 µg kg-1 在30分钟内输注完毕，随后以初始剂量的1/10每小时维持至实验结束。所有动物在脂多糖（LPS）输注后不久即出现休克表现。使用PiCCO系统监测血流动力学参数。动物表现出心脏指数下降和心率升高，提示休克状态下存在血流动力学不稳定。LPS输注后平均动脉压下降，但通过液体复苏或必要时输注去甲肾上腺素，使其维持在60 mmHg以上。图3）。肺损伤表现为 PaO₂ 降低2 FiO2-1 比值及肺动脉压力升高（图4）。使用近红外光谱法（NIRS）测量脑氧合，发现在休克诱导后脑氧合下降（图5...
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讨论
我们提出了一种通过输注脂多糖（LPS）在猪体内诱导实验性内毒素血症的方案，旨在可靠地引发脓毒症和感染性休克中常见的生理变化。该方案中需考虑若干关键步骤。在转运前对猪进行充分镇静至关重要，以防止应激引起的儿茶酚胺水平升高，从而可能影响实验结果。由于猪的吻部较长，其解剖结构使得插管操作相较于人类更具挑战性。为此，我们建议使用Macintosh喉镜片进行插管，且气管导管应配备直式导丝。会厌常与软腭粘连，此外，由于动物气管声门下区域存在狭窄，有时可能需要使用更小的气管导管——即使导管能够通过声带，仍可能因尺寸过大而无法顺利插入。
在输注LPS之前，必须精确配制LPS浓度。给予过高剂量的LPS可能导致严重的血流动力学不稳定甚至死亡，而剂量过低则可能无法产生预期效果。此外，需注意不同批次的LPS可能具有不同的效力。我们建议每次实验使用同一批次的LPS。可开展剂量探索性试验，以确定每项研究的合适剂量。一旦开始输注LPS，由于可能出现快速的血流动力学不稳定，持续监测血流动力学参数至关重要。必要时需及时干预，以处理任何不良反应。
PiCCO 用...
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披露
本研究中的近红外光谱（NIRS）设备由美国美敦力公司（Medtronic PLC）无偿提供，仅用于实验研究目的。Alexander Ziebart 收到了美敦力公司（Medtronic PLC）支付的讲课费。所有作者均声明不存在任何经济利益或其他利益冲突。本稿件由 ChatGPT®（Python Software，版本：2023 年 5 月 24 日）进行校对和编辑。
致谢
作者感谢 Dagmar Dirvonskis 提供的出色技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 阿曲库铵 Hikma 50 mg/5mL | Hikma Pharma GmbH，马丁斯里德 | ||
| 阿扎哌隆（Stresnil）40 mg/mL | Lilly Deutschland GmbH，德国巴特洪堡 | ||
| BD Discardit II 注射器 2、5、10、20 mL | Becton Dickinson S.A. Carretera, Mequinenza Fraga, 西班牙 | 注射器 | |
| BD Luer Connecta | Becton Dickinson Infusion Therapy, AB 赫尔辛堡，瑞典 | 三通止流阀 | |
| Curafix i.v. classics | Lohmann & Rauscher International GmbH & Co. KG，德国伦斯多夫 | 导管固定敷料 | |
| Datex Ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy，赫尔辛基，芬兰 | 血流动力学监测仪 | |
| Engströmöm Carestation | GE 医疗，美国麦迪逊 | 呼吸机 | |
| 芬太尼-Janssen 0.05 mg/mL | 扬森-西拉格有限公司，诺伊斯 | 芬太尼 | |
| Fü搅拌棒，直径 4.3 | Rüsch | 气管插管导引器 | |
| Incetomat-线 150 cm | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | 灌注管路 | |
| Intrafix Primeline | B. Braun Melsungen AG，德国美尔森 | 输液管路 | |
| 5 Fr. 引入鞘 | 泰尔茂医疗保健 | 动脉导引器 | |
| INVOS | Medtronic，爱尔兰都柏林 | 近红外光谱法 | |
| JOZA 一次性丁腈检查手套 | JOZA, Mü中国台湾，德国 | 一次性手套 | |
| 喉镜，45.48.50，KL 2000 | Medicon | 喉镜手柄 | |
| Littmann Classic III 听诊器 | 3M Deutschland GmbH，诺伊斯，德国 | 听诊器 | |
| LPS（大肠杆菌；血清型 O111:B4） | Sigma-Aldrich，瑞士 | ||
| MAC 双腔中心静脉通路套件 | Arrow国际公司，宾夕法尼亚州雷丁，美国 | 静脉导入器 | |
| 受损羊毛敷料 | Maimed GmbH，德国诺因基兴 | 用纱布垫固定舌头 | |
| Masimo LNCS Adtx SpO₂2 传感器 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 USA | 尾部饱和夹 | |
| Masimo LNCS TC-I SpO2 耳夹式传感器 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 美国 | 耳部饱和夹 | |
| Masimo Radical 7 | Masimo Corporation Irvine, Ca 92618 美国 | 外周血氧饱和度 | |
| 咪达唑仑 15 mg/3 mL | 德国 B.Braun Melsungen AG | ||
| Midmark 小型犬用塑料面罩，带隔膜，FRSCM-0005 | 美国俄亥俄州代顿市Midmark公司 | 犬用通气面罩 | |
| Monocryl 外科缝线 | Johnson & Johnson，比利时 | ||
| 德国B.Braun Melsungen AG | 生理盐水 | ||
| 0.9% NaCl | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | ||
| Octeniderm 无色 | Schülke & Mayr GmbH，德国诺登施泰特 | 酒精消毒剂 | |
| 原装 Perfusor 注射器 50 mL | 德国 B.Braun Melsungen AG | 灌注器注射器 | |
| PA-导管 Swan Ganz 7.5 Fr 110 cm | 美国加利福尼亚州尔湾市 Edwards Lifesciences LLC | Swan-Ganz导管 | |
| Perfusor FM Braun | 德国 B.Braun Melsungen AG | 注射泵 | |
| PiCCO 导管 | PULSION 医疗系统股份公司，菲尔德基兴，德国 | ||
| 1 M 氯化钾 | Fresenius, Kabi Germany GmbH | ||
| 丙泊酚 2% 20 mg/mL（50 mL 瓶装） | Fresenius, Kabi Deutschland, GmbH | ||
| 脉搏轮廓连续心输出量系统 PiCCO2 | PULSION Medical Systems SE，菲尔德基兴，德国 | ||
| Rüschelit Super Safety Clear >ID 6/6.5 /7.0 mm | Teleflex Medical Sdn. Bhd，马来西亚 | 气管插管 | |
| Sonosite Micromaxx 超声系统 | 美国华盛顿州博塞尔 Sonosite | 超声 | |
| 不锈钢 Macintosh 喉镜片öße 4 | Welch Allyn69604 | 喉镜片 | |
| Sterofundin | 德国梅尔松根B.Braun Melsungen AG公司 | 平衡电解质溶液 | |
| Vasco OP 敏感型 | 德国 B.Braun Melsungen AG | 无菌手套 | |
| Vasofix Safety 22 G-16 G | 德国 B.Braun Melsungen AG | 静脉导管 | |
| VBM 气囊压力计 | 德国，明辛根苏尔茨，VBM Medizintechnik GmbH公司 | 袖带压力计 |
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