Demonstratie van zelf-geassembleerde celbladcultuur en handmatige generatie van een 3D-pees/ligament-achtige organoïde met behulp van menselijke dermale fibroblasten
Summary
Hierin demonstreren we een organoïdemodel in drie stappen (tweedimensionale [2D] expansie, 2D-stimulatie, driedimensionale [3D] rijping) dat een veelbelovend hulpmiddel biedt voor fundamenteel peesonderzoek en een potentiële steigervrije methode voor peesweefselmanipulatie.
Abstract
Pezen en ligamenten (T/L) zijn sterke hiërarchisch georganiseerde structuren die het bewegingsapparaat verenigen. Deze weefsels hebben een strikt gerangschikte collageen type I-rijke extracellulaire matrix (ECM) en T/L-lijncellen die voornamelijk in parallelle rijen zijn gepositioneerd. Na een blessure hebben T/L veel tijd nodig voor revalidatie met een hoog faalrisico en vaak onbevredigende reparatieresultaten. Ondanks recente vooruitgang in het onderzoek naar T/L-biologie, is een van de resterende uitdagingen dat het T/L-veld nog steeds geen gestandaardiseerd differentiatieprotocol heeft dat in staat is om het T/L-vormingsproces in vitro te recapituleren. Bot- en vetdifferentiatie van mesenchymale voorlopercellen vereist bijvoorbeeld alleen standaard tweedimensionale (2D) celcultuur en de toevoeging van specifieke stimulatiemedia. Voor differentiatie naar kraakbeen is driedimensionale (3D) pelletcultuur en suppletie van TGFß noodzakelijk. Celdifferentiatie naar pezen vereist echter een zeer geordend 3D-kweekmodel, dat idealiter ook onderworpen zou moeten zijn aan dynamische mechanische stimulatie. We hebben een 3-staps (expansie, stimulatie en rijping) organoïdemodel opgesteld om een 3D-staafachtige structuur te vormen uit een zelfgeassembleerd celvel, dat een natuurlijke micro-omgeving levert met zijn eigen ECM-, autocriene en paracriene factoren. Deze staafachtige organoïden hebben een meerlagige cellulaire architectuur binnen rijke ECM en kunnen vrij gemakkelijk worden gehanteerd voor blootstelling aan statische mechanische belasting. Hier hebben we het 3-stappenprotocol gedemonstreerd door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare dermale fibroblasten. We zouden kunnen aantonen dat dit celtype robuuste en ECM-overvloedige organoïden vormt. De beschreven procedure kan verder worden geoptimaliseerd in termen van kweekmedia en geoptimaliseerd voor dynamische axiale mechanische stimulatie. Op dezelfde manier kunnen alternatieve celbronnen worden getest op hun potentieel om T/L-organoïden te vormen en zo T/L-differentiatie te ondergaan. Kortom, de gevestigde 3D T/L-organoïdebenadering kan worden gebruikt als model voor pezen basisonderzoek en zelfs voor steigervrije T/L-engineering.
Introduction
Pezen en ligamenten (T/L) zijn vitale componenten van het bewegingsapparaat die essentiële ondersteuning en stabiliteit bieden aan het lichaam. Ondanks hun cruciale rol zijn deze bindweefsels vatbaar voor degeneratie en letsel, wat pijn en verminderde mobiliteitveroorzaakt1. Bovendien kunnen hun beperkte bloedtoevoer en trage genezingsvermogen leiden tot chronische verwondingen, terwijl factoren zoals veroudering, repetitieve bewegingen en onjuiste revalidatie het risico op degeneratie en letsel verder vergroten. Conventionele behandelingen, zoals rust, fysiotherapie en chirurgische ingrepen, zijn niet in staat om de T/L-structuur en -functie volledig te herstellen. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers ernaar gestreefd om de ingewikkelde aard van T/L beter te begrijpen om effectieve behandelingen voor T/L-stoornissen te zoeken 3,4,5. T/L onderscheiden zich door een hiërarchisch georganiseerde, door extracellulaire matrix (ECM) gedomineerde structuur, die voornamelijk bestaat uit type I collageenvezels en proteoglycanen, een kenmerk dat moeilijk in vitro kan worden gerepliceerd 6. Traditionele tweedimensionale (2D) celcultuurmodellen slagen er niet in om de karakteristieke driedimensionale (3D) organisatie van T/L-weefsels vast te leggen, waardoor hun translationeel potentieel wordt beperkt en de innovatieve vooruitgang op het gebied van T/L-regeneratie wordt belemmerd.
Onlangs heeft de ontwikkeling van 3D-organoïdemodellen nieuwe mogelijkheden geboden voor het bevorderen van fundamenteel onderzoek en steigervrije weefselengineering van verschillende weefseltypen 7,8,9,10,11,12,13. Om bijvoorbeeld myotendineuze junctie te onderzoeken, ontwikkelden Larkin et al. 2006 3D-skeletspierconstructies samen met zelfgeorganiseerde peessegmenten afgeleid van rattenstaartpees10. Bovendien hebben Schiele et al. 2013, door gebruik te maken van micromachinale fibronectine-gecoate groeikanalen, de zelfassemblage van menselijke dermale fibroblasten geleid om cellulaire vezels te vormen zonder de hulp van een 3D-steiger, een benadering die de belangrijkste kenmerken van de ontwikkeling van embryonale pezen kan vastleggen11. In de studie van Florida et al. 2016 werden beenmergstromale cellen eerst uitgebreid tot bot- en ligamentlijnen, vervolgens gebruikt om zelfgeassembleerde monolaagse celvellen te genereren, die vervolgens werden geïmplementeerd om een multifasische bot-ligament-botconstructie te creëren die de oorspronkelijke voorste kruisband nabootst, een model gericht op een beter begrip van ligamentregeneratie12. Om peesmechanotransductieprocessen op te helderen, gebruikten Mubyana et al. 2018 een steigervrije methodologie waarbij enkele peesvezels werden gecreëerd en onderworpen aan mechanisch belastingsprotocol13. Organoïden zijn zelfgeorganiseerde 3D-structuren die de oorspronkelijke architectuur, micro-omgeving en functionaliteit van weefsels nabootsen. 3D-organoïdeculturen bieden een fysiologisch relevanter model voor het bestuderen van weefsel- en orgaanbiologie en pathofysiologie. Dergelijke modellen kunnen ook worden gebruikt om weefselspecifieke differentiatie van verschillende stam-/voorloperceltypen te induceren14,15. Daarom wordt het implementeren van 3D-organoïdemodellen op het gebied van T/L-biologie en weefselmanipulatie een zeer aantrekkelijke benadering 9,16. Alternatieve celbronnen kunnen worden geïmplementeerd voor de organoïde-assemblage en worden gestimuleerd in de richting van tenogene differentiatie. Een relevant celtype dat voor demonstratie in deze studie is gebruikt, zijn dermale fibroblasten 7,17,18. Deze cellen zijn gemakkelijk toegankelijk via een huidbiopsieprocedure, die minder invasief is in vergelijking met beenmergpunctie of liposuctie en door hun goede proliferatieve capaciteit vrij snel tot grote aantallen kan worden vermenigvuldigd. Daarentegen zijn meer gespecialiseerde celtypen, zoals T/L-residente fibroblasten, moeilijker te isoleren en uit te breiden. Daarom werden dermale fibroblasten ook gebruikt als uitgangspunt voor celherprogrammeringstechnologieën in de richting van geïnduceerde pluripotente embryonale stamcellen19. Het onderwerpen van dermale fibroblasten aan specifieke 3D-kweekomstandigheden en signaleringssignalen, zoals transformerende groeifactor-bèta 3 (TGFß3), waarvan is gemeld dat het fungeert als een belangrijke regulator van verschillende cellulaire processen, waaronder de vorming en het onderhoud van T/L, kan hun in vitro tenogene differentiatie versterken, wat leidt tot de expressie van peesspecifieke genen en de afzetting van T/L-typische ECM20, 21. okt.
Hier beschrijven en demonstreren we een eerder vastgesteld en geïmplementeerd 3-stappen (2D-expansie, 2D-stimulatie en 3D-rijping) organoïdeprotocol met behulp van in de handel verkrijgbare normale menselijke huidfibroblasten voor volwassenen (NHDF’s) als celbron, en bieden we een waardevol model voor het bestuderen van in vitro tenogenese7. Ondanks het feit dat dit model niet gelijk is aan in vivo T/L-weefsel, biedt het nog steeds een meer fysiologisch relevant systeem dat kan worden gebruikt voor het onderzoeken van cellulaire differentiatiemechanismen, het nabootsen van T/L-pathofysiologie in vitro en het opzetten van T/L-gepersonaliseerde geneeskunde en platforms voor het screenen van geneesmiddelen. Bovendien kunnen studies in de toekomst evalueren of de 3D-organoïden geschikt zijn voor steigervrije T/L-engineering door verdere optimalisatie en bruikbaar zijn voor de ontwikkeling van opgeschaalde mechanisch robuuste constructies die sterk lijken op de afmetingen en structurele en biofysische eigenschappen van native T/L-weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
De resultaten die in deze studie zijn aangetoond, bieden waardevolle inzichten in de oprichting en karakterisering van het NHDF 3D-organoïdemodel voor het bestuderen van T/L-weefsels. Het 3-stappenprotocol leidde tot de vorming van 3D-staafachtige organoïden die typische kenmerken van de T/L-niche vertonen. Dit model werd eerder gerapporteerd in Kroner-Weigl et al. 20237 en hier tot in detail gedemonstreerd.
De fasecontrastbeelden in figu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.D. en S.M.-D. erkenning van de BMBF-subsidie “CellWiTaL: Reproduceerbare celsystemen voor geneesmiddelenonderzoek – overdracht van laagvrije laserprinten van zeer specifieke afzonderlijke cellen in driedimensionale cellulaire structuren” Voorstel Nr. 13N15874. D.D. en V.R.A. erkennen de EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistische training van next-generation Osteoarthritis onderzoeken” GA Nr. 101034412. Alle auteurs zijn dankbaar voor mevrouw Beate Geyer voor haar technische assistentie.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
